课题3-血红蛋白的提取和分离

课题3血红蛋白的提取和分离课题背景蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作;血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和CO2的运输。在本课题中，我们将以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一些基本技术。凝胶颗粒在色谱柱中装填得十分紧密。图5-13为了清楚地表示分离过程，有意将凝胶颗粒画得稀疏。基础知识蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力，等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。在本课题中，我们将学习蛋白质分离方法中的凝胶色谱法。（一）凝胶色谱法凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离（图5-13）。a.相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进人凝胶颗粒内部而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。b.(1)蛋白质混合物上柱；(2)洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进人凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于颗粒之外；(3)相对分子质量较小的蛋白质被滞留，相对分子质量较大的蛋白质向下移动；(4)相对分子质量不同的分子完全分开；(5)相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。凝胶颗粒在色谱柱中装填得十分紧密。图5-13为了清楚地表示分离过程，有意将凝胶颗粒画得稀疏。（二）缓冲溶液缓冲作用在日常生活中并不少见。例如，运动鞋的鞋底富有弹性，能够缓冲外力，减少运动员受伤的几率（图5-14）。那么，缓冲溶液的缓冲作用体现在哪里呢？在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。缓冲溶液通常由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外溶液的pH与体内环境中的pH基本一致。因此，缓冲溶液的正确配制和pH的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极其重要的意义。（三）电泳电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动（图5-15)。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常用的电泳方法，在测定蛋白质分子量时通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N'-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶（图5-16）。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质的不同会有很大差异。在本课题中，我们以哺乳动物红细胞为材料，学习初步分离血红蛋白的方法。（一）样品处理及粗分离血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，除水分以外，约90%是血红蛋白。血红蛋白由四条肽链组成（图5-17），包括两条α-肽链和两条β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。本课题可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液来分离血红蛋白。为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂柠檬酸钠，比例是每100mL血液加入3.0g柠檬酸钠。1.红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液），缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。2.血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。3.分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的溶液分为4层（图5-18）。从上往下数，第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。4.透析取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0)，透析12h。透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。（二）凝胶色谱操作可以自己制作色谱柱，有条件的学校也可以直接购买商品色谱柱。1.凝胶色谱柱的制作取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端磨平。柱底部的制作方法如下（图5-19）。首先选择适合封堵玻璃管口的橡皮塞，中间打孔，孔径大小要能够紧密插入0.5mL的移液管。将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴，将0.5mL的移液管头部切下5cm长的一段，插入橡皮塞孔内，插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面。将尼龙网剪成与橡皮塞上部一样大小的圆片，覆盖在橡皮塞的凹穴上，再用大小合适的100目的尼龙纱将橡皮塞上部包好，插到玻璃管的一端。在色谱柱下端用移液管头部作出口部位，连接一细的尼龙管，并用螺旋夹控制尼龙管的打开与关闭，尼龙管的另一端放入收集色谱流出液的收集器内。柱顶部的制作只需在色谱柱的另一端插入安装了玻璃管的橡皮塞即可。2.凝胶色谱柱的装填装柱前要将色谱柱垂直固定在支架上。因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别很大，因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。本实验使用的是交联葡聚糖凝胶（SephadexG-75，图5-20）。“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。注意色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下（图5-21），用300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0)充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗?3.样品的加入和洗脱加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端（图5-22），注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集（图5-21）。(三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。在鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。有条件的学校，可以参考生物化学实验的有关书籍，尝试SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作。下图是聚丙烯酰胺凝胶电泳的装置及其原理示意图（图5-23）。操作提示1.红细胞的洗涤洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。有兴趣的同学可以尝试不同的洗涤次数、离心速度和时间，探索最佳处理条件。2.色谱柱填料的处理商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需直接放在洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需1~2h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。3.凝胶色谱柱的装填在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。4.蛋白质的分离在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？结果分析与评价1.你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2.你装填的凝胶色谱柱中是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？3.在蛋白质的分离过程中，你能观察到红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果。课题延伸在实际工作中，蛋白质的提纯往往需要联合使用几种分离方法，才能达到要求。你能在查阅资料的基础上，了解蛋白质的其他分离方法，设计出进一步纯化血红蛋白的方案吗？练习1.凝胶色谱法分离蛋白质的原理是怎样的？2.什么是缓冲溶液？它的作用是什么？3.电泳的作用及其原理是什么？4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？5.与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？