生物技术-毕业论文

正文11引言人类生命物体的基本特征之一就是不断地进行新陈代谢，新陈代谢是由许多有机化学反应组成的，如动植物的消化反应和各种物质的合成与分解等。这些反应在体内进行地很快，原因是有生命的动植物体内存在着的一种生物催化剂一酶的作用。酶制剂是在1833年由法国化学家佩思和珀索发现的，他们从麦芽提取液的酒精沉淀物中得到一种对热不稳定，而且能加速淀粉转变成糖的物质，称之为淀粉酶制剂。1926年隆姆首次从刀豆中提纯得到脲酶结晶[1]。生物化工行业经过70多年的发展，对酶的分子结构，酶作用的机理及酶系统的自我调节已形成了一个完整的工业体系。整个行业也出现了一些新的发展态势，在阐明生命活动的规律，探索工业、农业、畜牧业、医药及对疾病的诊断、治疗均有重要的意义。2酶在工程技术反应中的特点与功能2.1酶及酶工程简介酶（enzyme）（图2-1）是指由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白质组成（少数为RNA）。能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础。细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。图2-1酶哺乳动物的细胞就含有几千种酶。它们或是溶解于细胞质中，或是与各种膜结构结合在一起，或是位于细胞内其他结构的特定位置上。这些酶统称胞内酶；另外，还有一些在细胞内合成后再分泌至细胞外的酶──胞外酶[2]。酶催化化学反应的能力叫酶活力（或称酶活性）。酶活力可受多种因素的调节控制，从而使正文2生物体能适应外界条件的变化，维持生命活动。没有酶的参与，新陈代谢只能以极其缓慢的速度进行，生命活动就根本无法维持。例如食物必须在酶的作用下降解成小分子，才能透过肠壁，被组织吸收和利用。在胃里有胃蛋白酶，在肠里有胰脏分泌的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等。又如食物的氧化是动物能量的来源，其氧化过程也是在一系列酶的催化下完成的。酶工程就是将酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能,借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。它包括酶制剂的制备,酶的固定化,酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容。酶工程的应用，主要集中于食品工业，轻工业以及医药工业中[1]。2.2酶的特点2.2.1酶与无机催化剂比较（1）相同点：①改变化学反应速率，本身几乎不被消耗；②只催化已存在的化学反应；③加快化学反应速率，缩短达到平衡时间，但不改变平衡点；④降低活化能，使化学反应速率加快。⑤都会出现中毒现象。（2）不同点：即酶的特性。2.2.2酶的特性（1）高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；（2）专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽；（3）多样性：酶的种类很多，大约有4000多种；（4）温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的。（5）活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。（6）有些酶的催化性与辅因子有关。（7）易变性：由于大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏。一般来说，动物体内的酶最适温度在35～40℃之间，植物体内的酶最适温度在40～50℃之间；细菌和真菌体内的酶最适温度差别较大，有的酶最适温度可高达70℃。动物体内的酶最适PH大多在6.5～8.0之间，但也有例外，如胃蛋白酶的最适PH为1.5，植物体内的酶最适PH大多在4.5～6.5之间。酶的这些性质使细胞内错综复杂的物质代谢过程能有条不紊地进行，使物质正文3代谢与正常的生理机能互相适应．若因遗传缺陷造成某个酶缺损，或其它原因造成酶的活性减弱，均可导致该酶催化的反应异常，使物质代谢紊乱，甚至发生疾病．因此酶与医学的关系十分密切。2.2.3酶的功能全酶(结合蛋白酶)：酶蛋白+辅助因子。辅助因子是结合蛋白必需成分。它包括辅酶(或辅基)和金属离子两类。辅酶或辅基是一些小分子的有机化合物，其中大多数都是维生素B族的衍生物。酶活力与酶分子的结构有着密切的关系。酶蛋白的氨基酸组成和连接方式与一般蛋白质一样，都具有特定的氨基酸排列顺序和空间构造。实验证明：在酶蛋白分子中，只有某些氨基酸残基的化学基因与催化活性直接有关，由这些氨基酸残基构成特殊结构的区域称为酶的活性中心。活性中心所包含的化学基因为发挥酶催化作用所必需的关键部位。有些酶(绝大多数为蛋白水解酶)在细胞内合成或初分泌时并不表现有酶活力，这种无活性状态的酶前身物称为酶原。它必须经温度因素作用后转变成有活力酶，这种过程称为酶原的激活。以酶原的形式存在具有重要生理意义。如细胞产生的蛋白酶原可以避免对细胞自身蛋白质的消化作用。当蛋白酶原由细胞分泌排入肠腔时，酶原被激活而发挥催化作用。现代研究中多广泛运用同工酶，它是化学反应相同，而酶蛋白的结构和理化性质不同的一组酶。这类酶存在于生物的同一种属或同一机体的不同组织细胞中。自1959年首先发现乳酸脱氢酶(LDH)同工酶以来，已发现同工酶约有500多种，其中研究应用最多的是LDH同工酶。广泛用于生物化工中，对研究细胞分化、遗传、生态、工业、农业的经济性状，抗病力和疾病诊断等探讨具有一定的意义[2]。3酶在工程技术中的基本原理3.1催化作用原理酶催化作用实质：降低化学反应活化能。酶的作用原理在于研究酶与底物相互作用和变化的过程。下面来说明酶为什么会有这样高的催化效率：在化学反应体系中，反应物分子所含的能量并不相同，但平均能量水平较低。在反应的一瞬间，只有那些含能量分子较高，已达到或超过一定水平的分子才能参与化学反应，即反应物分子必须超过一定的能量，才能成为活性状态，这种分子叫活化分子。反应物分子由一般状态转变为活化状态所需要的能量，称为活化能。反应体系的活化分子愈多，反应速度就愈快。酶能显正文4著地降低反应活化能，加速化学反应。所以催化效率比一般催化剂高。3.2酶的活力1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1min内能转化1μmol底物的酶量，或是转化底物中1μmol的有关基团的酶量。比活力（specificactivity）:每分钟每毫克酶蛋白在25℃下转化的底物的微摩尔数。比活力是酶纯度的测量。活化能（activationenergy）:将1mol反应底物中所有分子由基态转化为过度态所需要的能量。活性部位（activesite）:酶中含有底物结合部位和参与催化底物转化为产物的氨基酸残基部分。活性部位通常位于蛋白质的结构域或亚基之间的裂隙或是蛋白质表面的凹陷部位，通常都是由在三维空间上靠得很紧的一些氨基酸残基组成。3.3酶活力测定初速度(initialvelocity)：酶促反应最初阶段底物转化为产物的速度，这一阶段产物的浓度非常低，其逆反应可以忽略不计。米氏方程（Michaelis-Mententequation）:表示一个酶促反应的起始速度（υ）与底物浓度([s])关系的速度方程：υ=υmax[s]/(Km+[s])催化常数等于最大反应速度除以总的酶浓度（υmax/[E]total）。或是每摩酶活性部位每秒钟转化为产物的底物的量（摩[尔]）。双倒数作图（图3-1）:也称为Lineweaver_Burk作图。一个酶促反应的速度的倒数（1/V）对底物度的倒数（1/CS）的作图。x和y轴上的截距分别代表米氏常数和最大反应速度的倒数。图3-1：米氏常数的图解计算——双倒数作图法正文53.4影响酶反应速度的因素3.4.1酶浓度对酶促反应速度的影响从米门公式和酶浓度与酶促反应速度的关系图解可以看出：酶促反应速度与酶分子的浓度成正比。当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。但事实上，当酶浓度很高时，并不保持这种关系，曲线逐渐趋向平缓。根据分析，这可能是高浓度的底物夹带夹带有许多的抑制剂所致。3.4.2底物浓度对酶促反应速度的影响在生化反应中，若酶的浓度为定值，底物的起始浓度较低时，酶促反应速度与底物浓度成正比，即随底物浓度的增加而增加。当所有的酶与底物结合生成中间产物后，即使在增加底物浓度，中间产物浓度也不会增加，酶促反应速度也不增加。还可以得出，在底物浓度相同条件下，酶促反应速度与酶的初始浓度成正比。酶的初始浓度大，其酶促反应速度就大。在实际测定中，即使酶浓度足够高，随底物浓度的升高，酶促反应速度并没有因此增加，甚至受到抑制。其原因是：高浓度底物降低了水的有效浓度，降低了分子扩散性，从而降低了酶促反应速度。过量的底物聚集在酶分子上，生成无活性的中间产物，不能释放出酶分子，从而也会降低反应速度。3.4.3温度对酶促反应速度的影响各种酶在最适温度范围内，酶活性最强，酶促反应速度最大。在适宜的温度范围内，温度每升高10℃，酶促反应速度可以相应提高1～2倍。不同生物体内酶的最适温度不同。如，动物组织中各种酶的最适温度为37～40℃；微生物体内各种酶的最适温度为25～60℃，但也有例外，如黑曲糖化酶的最适温度为62～64℃；巨大芽孢杆菌、短乳酸杆菌、产气杆菌等体内的葡萄糖异构酶的最适温度为80℃；枯草杆菌的液化型淀粉酶的最适温度为85～94℃。可见，一些芽孢杆菌的酶的热稳定性较高。过高或过低的温度都会降低酶的催化效率，即降低酶促反应速度。最适温度在60℃以下的酶，当温度达到60～80℃时，大部分酶被破坏，发生不可逆变性；当温度接近100℃时，酶的催化作用完全丧失。3.4.4pH对酶促反应速度的影响酶在最适pH范围内表现出活性，大于或小于最适pH，都会降低酶活性。主要表现在两个方面：①改变底物分子和酶分子的带电状态，从而影响酶和底物正文6的结合；②过高或过低的pH都会影响酶的稳定性，进而使酶遭受不可逆破坏。人体中的大部分酶所处环境的pH值越接近7，催化效果越好。但人体中的胃蛋白酶却适宜在pH值为1～2的环境中，胰蛋白酶的最适pH在8左右[4]。3.4.5激活剂对酶促反应速度的影响能激活酶的物质称为酶的激活剂。激活剂种类很多，有①无机阳离子，如钠离子、钾离子、铜离子、钙离子等；②无机阴离子，如氯离子、溴离子、碘离子、硫酸盐离子磷酸盐离子等；③有机化合物，如维生素C、半胱氨酸、还原性谷胱甘肽等。许多酶只有当某一种适当的激活剂存在时，才表现出催化活性或强化其催化活性，这称为对酶的激活作用。而有些酶被合成后呈现无活性状态，这种酶称为酶原。它必须经过适当的激活剂激活后才具活性。3.4.6抑制剂对酶促反应速度的影响能减弱、抑制甚至破坏酶活性的物质称为酶的抑制剂。它可降低酶促反应速度。酶的抑制剂有重金属离子、一氧化碳、硫化氢、氢氰酸、氟化物、碘化乙酸、生物碱、染料、对-氯汞苯甲酸、二异丙基氟磷酸、乙二胺四乙酸、表面活性剂等。对酶促反应的抑制可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。与底物结构类似的物质争先与酶的活性中心结合，从而降低酶促反应速度，这种作用称为竞争性抑制。竞争性抑制是可逆性抑制，通过增加底物浓度最终可解除抑制，恢复酶的活性。与底物结构类似的物质称为竞争性抑制剂。抑制剂与酶活性中心以外的位点结合后，底物仍可与酶活性中心结合，但酶不显示活性，这种作用称为非竞争性抑制。非竞争性抑制是不可逆的，增加底物浓度并不能解除对酶活性的抑制。与酶活性中心以外的位点结合的抑制剂，称为非竞争性抑制剂。有的物质既可作为一种酶的抑制剂，又可作为另一种酶的激活剂。4酶在工程技术中的开发研究酶工程技术包括酶源开发、酶制剂生产、酶分离提纯和固定化技术，酶反应器与酶的作用。目前世界酶制剂从酶源的应用都已进入了良性发展阶段，各级生产企业和科研院所与用户关系密切，合作广泛。据报道，2010年全球工业酶制剂的销售额为30亿美元，预计到2020年将增长到60亿美元，每年为6．5％的速率增长。其中食用酶占40％，洗涤用酶占33％，其他(主要是纺织、造纸和饲料等用酶)占27％[5]。（图4-1）正文7图4-1：酶制剂在各行业所占百分比利用基因工程技术，不但成倍地提高了酶的活力，而且还可将生物酶基因克隆到微生物中，构建基因