封闭

封闭的原理：固相载体表面（如ELISA板，NC膜或者PVDF膜上等）有很多洞洞，通过电转或包被，胶上的蛋白被转移到了膜上，或抗原/抗体固定在板上，蛋白以机械填补（堆积）和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面的很多洞洞里面，但蛋白并不是连续的，有很多空隙，而且比如说样品孔之间也有空隙，这些洞洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样，就会有很多非特异性的信号。封闭液中的蛋白可以与表面上的空白位置结合，同样以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在膜上，因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异结合，所以有“封闭”的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够很牢固的结合在空白位置上。这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。封闭剂应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白、不结合靶蛋白表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应，封闭所用试剂：1、BSABSA是最常用的封闭剂，成分单一适用于大多数情况。若免疫原是偶联BSA的，BSA有很强的免疫原性，会导致产生很多的针对BSA的抗体，为避免交叉反应，不能用BSA、脱脂奶粉等封闭，可以选用酪蛋白或无蛋白的封闭剂封闭。大部分BSA中有少量的抗体残留，会导致抗原/抗体之间的交叉反应，产生高背景，杂带较多或使得本底水平增高。2、血清封闭血清的原理主要有两点，第一是待检样本会有些与蛋白非特异性结合的物质，从而导致背景过高，因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。免疫组化中用血清封闭的较多。封闭血清一般选择和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。但要注意封闭用血清中不能含有目标蛋白，且与一抗来源不同。另外二抗因尽量少选取兔子或老鼠来源的，因为这两个在亲缘关系上和人类非常接近，所以产生交叉反应的机会就比较大，从而导致背景比较高。!适合选用来源于驴，山羊，绵羊等的二抗，背景相对就很低。3、脱脂奶粉脱脂奶粉最大的优点是价钱便宜，所以是首选，但是由于成分相对复杂，所以适用范围要狭窄一些。磷酸化抗体也许会导致背景增加，此外，因为自身含有生物素,不能用于生物素标记的抗体系统。奶粉蛋白种类比BSA多，而WB膜也好，ELISA板也好，表面的微结构都不是那么均匀的，相对而言，不同分子量蛋白种类多的奶粉（BSA只是一种蛋白），封闭起来更全面。脱脂奶粉中含有少量的生物素和碱性磷酸酶残留，在使用生物素-亲和素系统和碱性磷酸酶标记的二抗时，也会使得高背景或本底水平增高。由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。4、酪蛋白和BSA作用类似，普通酪蛋白不易溶解。中性和碱性条件下带有负电性，与同样带负电荷胶体金之间存在排斥力，而膜一般都是带正电荷，会与酪蛋白有一定的吸附作用，用酪蛋白封闭效果好些。5、无蛋白化合物甲醛：与PVDF膜表面的微结构反应或者结合，使之失去结合蛋白的疏水力或者空间结构域。去污剂（吐温-20）：有抗原修复的作用，与膜疏水性吸附，有很强的对非特异性吸附的洗脱作用，同样可以降低蛋白间的疏水作用，可提高特异性抗体的识别能力。还有明胶，PEG等也可作为封闭剂。