纸质微流控芯片与癌症标志物检测

1纸质微流控芯片与癌症标志物检测XXX1*（1.XXXXXX，XXXXXXXX）摘要：癌症标志物的检测在癌症的早期诊断治疗中具有重要意义。而纸质微流控芯片具有成本低，易携带，操作简单，检出限低，可大规模量产等优点，符合了癌症标志物检测要求。本文在此介绍纸质微流控芯片的特殊优点，制作原理和方法，研究进展，在检验医学中的应用，以及需要改进的地方。关键词：纸质微流控芯片；癌症标志物；临床检测；应用中图分类号：O657文献标志码：APaper-BasedmicrofluidicanalyticaldevicesfordetectionofcancerbiomarkersXXX1*(XXX,XXX,XXX,XXX,XXX,XXX)Abstract:Thedetectionofcancerbiomarkersisimportantinearlydiagnosis.Paper-Basedmicrofluidicanalyticaldevices(μPADs)hasmanyadvantages.Itmeetsthedemandofdetectionofcancerbiomarkers.ThispaperintroducetheuniqueadvantagesofμPADs,theprincipleandmethodsofμPADs’sproduction,researchonit,applicationofitandit’sdisadvantages.Keywords:Paper-Basedmicrofluidicanalyticaldevices,cancerbiomarkers,detection,application.据世界卫生组织统计，2012年癌症造成820万人死亡，成为全球的一个主要死亡原因。因此，癌症的早期诊断与治疗尤为重要。癌症标志物是指恶性肿瘤细胞在增值等过程中分泌释放出来的蛋白质，激素，酶等生物活性性质，它可以反映恶性肿瘤的存在以及生长情况。[1]所以临床医学上需要一种高水平的癌症标志物检测方法。微流控芯片(μPADs)正是近年来兴起的一种新技术，它具有成本低，高灵敏度，高效率等新优点，可以用来替代早期检测方法如化学发光法或酶联免疫分析法。纸质微流控芯片是微流控芯片中最具有发展前景的一种技术之一。本文将对该技术进行简单的综述。1.纸质微流控芯片的优点普通意义上的微流控芯片有如下优点：1.系统通常微信化，易于携带。2.分析所需的试样试少，环境污染少。3.集成化，自动化，应用范围广，涉及化学，生命科学，材料，医学等领域。4.分析速度快，可多通道分析。[2~4]纸质微流控芯片还具有它的特殊优点[5]：1.纸在任何地方都可以得到而且价格便宜。（甚至是高级层析纸如Whatmanchromatographypaper#1(200.0mm×200.0mm,purecellulosepaper)也不是很贵）2.它可以通过毛细作用吸收被测液体3.可以对纸的表面进行修饰，让它具有更多应用4..纸是由纤维素构成的，具有良好的生物相容性5.纸是可燃的，在实验结束后，通过简单的燃烧办法处理即可6.纸是白色的，非常利于比色分析7.利用现有的印刷技术就可以在纸上进行通道刻蚀，表面加工等。2.纸质微流控芯片的制作方法22.1传统微流控芯片与纸质微流控芯片制作方法区别传统的微流控芯片是在玻璃，硅橡胶，PDMS或者其他塑料或者高分子材料上刻蚀通道得到。而μPADs的制作主要是用疏水的材料做成屏障来得到一些亲水的通道。（图一μPADs亲水通道示意图[4]）现在已有好几种方法来制作μPADs[6]。主要有紫外光刻，蜡印，融蜡浸透，丝网印刷，绘图，喷墨打印等等。本文中着重介绍紫外光刻与蜡印法以及3D-μPADs的制作。而通过不同制作方法得到的μPADs之间的比较见图六。2.2紫外光刻法通过物理吸附，物理沉积等方法将光刻胶修饰在滤纸上，然后在掩膜保护下，用紫外光照射特定的区域曝光区域的光刻胶发生聚合，再用化学洗涤剂洗去未曝光部分的光刻胶，这样就得到了亲水通道。这里仔细介绍Whitesides小组[6]制作μPADs的方法。首先。他们将7.5cm直径的层析纸浸透在2ml的SU-82010光刻胶中30s,然后再2000rpm下离心分离30s,再在95℃下烘烤5min，。他们再把掩膜保护下的层析纸暴露在405-nm的紫外线（50mWcm-2)中照射10s。照射后，将层析纸再次与96℃下烘烤5min来使曝光部分的光刻胶聚合。最后用PGMEA来洗去未曝光部分的光刻胶，洗涤时长5min。这样就得到了有刻蚀通道的层析纸，为了增加它的亲水性，可以把它的整个表面暴露在600millitorr的氧等离子体中10s。整个制作过程完毕。2.3蜡印法在层析纸的特定区域上固定上蜡，然后将层析纸置于90℃恒温干燥箱20min左右，使蜡层正好均匀渗透到下层，而不会过度扩散。2.43D-μPADs的制作通过疏水材料隔离不同的芯片层，再用不同的孔道连通层与层之间，达到三维立体的效果。（图二紫外光刻法制作流程示意图[7]）（图三蜡印法制作流程示意图[5]）（图四两种方法制作出来的μPADs[5]）3（图五3D-μPADs的制作流程图[4]）3.纸质微流控芯片的工作原理被测液体通过亲水通道到达测试区，在测试区可以通过电化学检测分析法，化学比色检测分析法，化学发光余电化学发光检测分析法等一系列的分析化学方法来检测出对待测物进行定量分析。（图六用各种制作方法得到的μPADs之间的比较[5]）44.纸质微流控芯片的分析检测方法4.1比色检测最常用最简单的检测方法就是比色检测法。待测物与测试区的分析试剂发生反应，利用化学反应，酶联免疫反应的显色效应，通过颜色指示来对待测物的多个指标进行定量分析。例如，图七就是比色检测法的一种应用。这种检测方法是成本最低，最简单的方法。它可以用于远程医疗检测，例如一个病人用纸质微流控芯片得到颜色信息，用带有摄像头的手机进行拍照再通过互联网传送到远方的医生那里，医生就可以进行结果分析和病情预测。然而它也有很大的缺点，那就是灵敏度和准确度过低。4.2电化学检测YafengWu[8]等人就曾用微分脉冲极谱法来对AFP(甲胎蛋白，肝癌的标志物)，CEA(癌胚抗原，广谱性的肿瘤标志物，可用作大肠癌，乳腺癌，肺癌的标志物。)，CA125(一种糖蛋白，是卵巢癌的特异性标志物)，CA153(一种乳腺癌最重要的标志物)[9]这四种癌症标志物进行定量分析。通过电流大小的计算得到各个癌症标志物的含量。这种检测方法具有灵敏度高，选择性强，易于集成化和微型化等优点[6]。目前安培法是应用最多的一种，此外还有电位法，伏安法与电导法。（图七葡萄糖与BSA的浓度与显示颜色之间的关系[7]）（图八电流强度与待测物浓度的关系[8]）54.3其他检测方法除了以上两种方法外，还有化学发光与电化学发光检测法。Yu[6]等人利用化学发光的方法成功对葡萄糖和尿酸进行定量检测。Delaney[6]等人也成功的对DBAE与NADH利用化学发光的方法进行检测。我认为电流型生物传感器也能用于纸质微流控芯片的检测之中。比如说，通过检测某种生物酶降解癌症标志物（蛋白类）这一反应中的反应电流来最待测物进行定量分析。若是待测物中有共轭大π键，是否可以尝试用分子荧光，分子磷光法。或者尝试场致发光，热致发光，催化发光等等其他的发光方法。4.4对纸质微流控芯片的改进YafengWu[8]等人在用纸质微流控芯片对癌症标志物进行电化学检测的过程中首次提出了一种信号放大的方法。首先,他们在层析纸上覆盖一层氧化石墨烯（GO)，接着在上面修饰上甲胎蛋白抗体(anti-AFP)以及牛血清白蛋白（BSA）。同时他们用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)修饰二氧化硅纳米球的表面，然后在纳米球的表面修饰上甲胎蛋白抗体(anti-AFP)和辣根过氧化酶（HRP)。检测过程就是甲胎蛋白被同时吸附在分别连着二氧化硅纳米球与GO的甲胎蛋白抗体，使两者连为一体，再用微分脉冲极谱分析法检测电流强度，从而达到对待测物定量检测的目的。（图九改进方法示意图[8]）该实验小组得到的电流强度与待测物浓度之间的关系已经在图八中列出。同时，他们从本实验中得到四种标志物电流与浓度之间的线性回归方程I=3.55+1.1log(CAFP/ngmL−1)(R2=0.9969),I=3.14+1.04log(CCEA/ngmL−1)(R2=0.9940),I=3.67+0.95log(CCA125/ngmL−1)(R2=0.9974),I=3.14+0.84log(CCA153/ngmL−1)(R2=0.9958)。此外，他们对其他实验影响因素进行了测定，得到如图中所示结果。（图十影响实验结果的其他因素[8]）这些实验数据为我们做其他癌症标志物检测6的实验时提供了一些参考。也为纸质微流控芯片对甲胎蛋白的检测进行了参数优化，有利于加速它的工业化进程。该小组通过这种方法成功的将四种癌症标志物的检出限降至为0.001,0.005,0.001,和0.005ngmL−1,明显的优于现有的检测技术。5.纸质微流控芯片的应用具有多学科综合优势的纸质微流控芯片在实验室中有多方面的应用，将来在生活中也会有广泛应用。下表列出了纸质微流控芯片的检测及应用。6.展望作为最前沿的分析技术之一，纸质微流控芯片具有许多其他检测方法所不具有的独特优点。尤其是它的成本，非常非常低，可以很容易的工业化推广。就发展中国家来说，它们缺少足够的医疗资源，没有有效的癌症检测方法，如果纸质微流控芯片在癌症诊断上的应用成功实现并得到推广，这对于那些发展中国家的贫穷病人来说将会是非常大的福音。也许未来的某一天，检测癌症将会变得用PH试纸检测PH一样简单。如果我们把思路开阔一下，意识到所有的检测都是相通的。我们还能将纸质微流控芯片用于疾病检测，环境检测，食品安全检测，地质资源勘查等等方面。所以，对于纸质微流控芯片的研究是非常必要的。就目前而言，纸质微流控芯片还处于发展的初期，现有的技术无法满足真正实际应用的需求。（表十一纸质微流控芯片的检测与应用[6]）7因此纸质微流控芯片的研究与发展应当在以下几个方面努力：1.充分发挥纸芯片多检测物同时分析的优势，在这方面进行更多的研究。2.寻找更为简单又不会降低灵敏度的制作工艺。3.对层析纸的表面修饰技术进行研究，寻找更多的修饰方法，拓宽纸芯片的检测面。4.充分运用现代社会中智能手机拍照功能与发达的互联网，将纸芯片的应用到远程医疗诊断中。5.开发更好的检测技术，虽然比色法很简单实用，可是毕竟准确度偏低，而电化学检测法虽然灵敏度高，却难以实现在纸芯片上微电机阵列，因此，检测技术方面需要更多研究。参考文献：[1].陈燕．肿瘤标志物临床应用原则[J]．医学检验与临床2006，117：1-2．[2].岳志红张正，微流控芯片技术及其在检验医学中的应用[J]，现代仪器，2004，（5）：14-16[3].蔡绍皙，郭志刚，微流控芯片分析技术在生化研究中的应用进展[J]．生物技术通报，2010，(011)：68．71．[4].齐云龙丁永胜，图解纸芯片制作及应用进展[J]，现代仪器与医疗2013，19(3):7-14[5].AndresW.Martinez等，DiagnosticsfortheDevelopingWorld:MicrofluidicPaper-BasedAnalyticalDevices[J],Anal.Chem.2010,82,3–10[6].蒋艳等,微流控纸芯片的加工技术及其应用[J],化学进展2014，26(1)：167~177[7].GeorgeM.Whiteside等，PatternedPaperasaPlatformforInexpensive,Low-Volume,PortableBioassays，Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,1318~1320[8].KamM.Hui，YafengWu等，Paper-BasedMicrofluidicElectrochemic