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云南大学学报(自然科学版),2008,30(2):202~206犆犖53-1045/犖犐犛犛犖0258-7971犑狅狌狉狀犪犾狅犳犢狌狀狀犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔甲/戊型肝炎病毒重组抗原基因的克隆及表达奎翔,李鸿钧,谢天宏,张光明,刘馨,易山,杨芳,彭梅,马开利,孙茂盛(中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所分子生物室,云南昆明650118)摘要:将甲肝病毒狏狆1编码基因(犪犪24~171)和戊型肝炎病毒犗犚犉2基因(犪犪431~615)通过一段编码柔性甘氨酸链(犌犾狔4犛犲狉犌犾狔4)的基因片断连接,获得编码犎犃犞/犎犈犞融合蛋白基因(犃犈犃犵342).将该融合基因插入质粒狆犅犞220,构建表达质粒狆犅犞220-犃犈犃犵342.将狆犅犞220-犃犈犃犵342转化入大肠杆菌犅犔21中进行表达,表达量约占菌体总量的20%,经离子交换层析纯化,目的蛋白纯度达90%以上.犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋证实该蛋白能与甲肝及戊肝患者阳性血清发生特异性反映,为进一步开发双价疫苗和联合诊断试剂奠定了一定基础.关键词:甲型肝炎病毒;戊型肝炎病毒;基因克隆;表达;类病毒颗粒中图分类号:犙789文献标识码:犃文章编号:0258-7971(2008)02-0202-05戊型肝炎病毒是引起肠道传播的非甲非乙型肝炎(即戊型肝炎,犎犈)的病原体.由于尚未建立起有效的细胞培养模型或简便的病毒增殖模型,难以进行传统的灭活疫苗或减毒疫苗的研制,基因工程疫苗的研制成为各国学者研究的焦点,而其犗犚犉2羧基末端能自发形成类病毒颗粒(犞犔犘),成为研制基因工程疫苗的首选靶点.犎犃犞与犎犈犞从分子病毒学到流行病学及其引起的临床症状都有许多相似之处,甲戊双价疫苗和联合检测试剂盒的开发有助于甲肝及戊肝的预防和早期诊断.犎犈犞的中和表位主要位于犗犚犉2的犆端[2],其氨基酸序列比较保守.能结合犎犈犞中和抗体的最小犗犚犉2片段位于犪犪452~617之间,该片段不仅能引发中和抗体,还能与其他型别的抗体发生交叉反应[3].犎犃犞只有一个血清型,虽然有多个基因型,但它们的主要差别在5′犖犜犚区,其编码蛋白区是保守的[4].犎犃犞狏狆1的抗原表位则位于犪犪1~221之间[5].本研究选取了犗犚犉2犪犪431~615及狏狆1犪犪24~171之间的多肽作为研究对象,表达融合蛋白犃犈犃犵342,以期能形成嵌合犞犔犘,提高犗犚犉2和狏狆1的抗原性.1材料和方法1.1菌株和质粒大肠杆菌犇犎5α,犅犔21及质粒狆犅犞220,含有犎犈犞犗犚犉2的质粒狆犈犎犌2及含有犎犃犞狏狆1的质粒狆犎犃犞-1均由本室保存.1.2试剂犘犳狌犇犖犃聚合酶、限制性内切酶犛犪犾Ⅰ,犈犮狅犚Ⅰ及犜4犇犖犃连接酶购自犜犪犓犪犚犪犅犻狅公司;犘犆犚产物快速回收试剂盒购自犜犐犃犖犌犈犖公司;质粒抽提试剂盒购自犠犪狋狊狅狀犅犻狅公司;辣根过氧化物酶(犎犚犘)标记的山羊抗人犐犵犌购自武汉博士德生物工程公司;人抗犎犃犞,犎犈犞血清来自昆明传染病医院甲型及戊型肝炎患者;其他试剂均为国产分析纯.1.3重组基因片断的扩增设计犎犈犞犗犚犉2犪犪431~615(犎犈犃犵185)基因扩增引物犘1,犘2,在正向引物犘1引入酶切位点犈犮狅犚Ⅰ及起始密码子犃犜犌(下划线部分),反向引物犘2引入甘氨酸连接肽(犌犾狔4犛犲狉犌犾狔4,下划线部分):犘1:5′-犃犌犜犌犃犃犜犜犆犃犜犌犃犜犆犌犃犆犆犜犆犌犌犌犌犃犃犜犆犜犆-3′;犘2:5′-犃犆犆犃犆犆犃犆犆犃犆犆犃犆犜犃犆犆犃犆犆犃犆犆犃犆犆收稿日期:2007-11-20基金项目:云南省中青年学术技术带头人后备人才培养基金资助(2005犘犢01-24).作者简介:奎翔(1980-),男,云南人,硕士生,主要从事生物化学与分子生物学方面的研究.通讯作者:李鸿钧(1969-),男,云南人,副研究员,主要从事分子生物学方面的研究,犈-犿犪犻犾:犾犻犺犼6912@犺狅狋犿犪犻犾.犮狅犿.犌犜犆犆犃犜犌犌犜犃犜犆犆犜犆犃犃犌犆犃犃犜-3′.根据犖犆犅犐公布的犎犃犞(犎犕175株)狏狆1犪犪24~171(犎犃犃犵148)的基因序列,设计引物犘3,犘4,正向引物犘3引入与犘2互补的甘氨酸连接肽序列,反向引物犘4中引入酶切位点犛犪犾Ⅰ及终止密码子(下划线部分):犘3:5′-犌犌犜犌犌犜犌犌犜犌犌犜犃犌犜犌犌犜犌犌犜犌犌犜犌犌犜犌犌犜犃犜犃犃犆犃犃犆犆犃犜犌犃犃犃犌犃犜犜犜犌-3′;犘4:5′-犆犃犌犜犆犌犃犆犜犜犃犜犃犆犆犆犃犃犌犌犃犌犜犃犜犆犃犃犆犌犌-3′.以狆犈犎犌2为模板,用引物犘1,犘2扩增犎犈犃犵185,50μ犔反应体系如下:1×反应缓冲液(含1.5犿犿狅犾/犔犕犵犆犾2),模板1狆犵,引物各1μ犿狅犾/犔,4×犱犖犜犘0.2犿犿狅犾/犔,狆犳狌酶2犝.反应条件:97℃预变性5犿犻狀进入循环,97℃变性40狊,54.3℃30狊,72℃1犿犻狀,循环29次,最后97℃变性1犿犻狀,53.3℃30狊,72℃10犿犻狀.再以质粒狆犎犃犞-1为模板,用引物犘3,犘4扩增犎犃犃犵148基因,50μ犔反应体系如下:1×反应缓冲液(含1.5犿犿狅犾/犔犕犵犆犾2),模板1狆犵,引物各0.5μ犿狅犾/犔,4×犱犖犜犘0.2犿犿狅犾/犔,狆犳狌酶2犝.反应条件(降落犘犆犚):97℃预变性5犿犻狀,97℃变性40狊,复性温度60~55℃,每减1℃循环2次,55℃循环5次,53℃循环5次,每个循环的延伸温度为72℃,1犿犻狀,最后72℃延伸10犿犻狀.用上述犘犆犚产物各取5μ犔进行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收.然后借助2个扩增基因之间甘氨酸连接肽互补区,利用重组犘犆犚,即重叠延伸剪接术(犛狆犾犻犮犻狀犵犫狔狅狏犲狉犾犪狆犲狓狋犲狀狊犻狅狀,犛犗犈)拼接和扩增犎犃犃犵148-肽-犎犈犃犵185(犃犈犃犵342)[6].50μ犔反应体系如下:1×反应缓冲液(含1.5犿犿狅犾/犔犕犵犆犾2),模板犎犃犃犵148和犎犈犃犵185各1狆犵,引物犘1,犘4各0.5μ犿狅犾/犔,4×犱犖犜犘0.2犿犿狅犾/犔,狆犳狌酶2犝.反应条件同上述降落犘犆犚.扩增产物犃犈犃犵342经1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收.1.4重组表达质粒狆犅犞220-犃犈犃犵342的构建上述纯化的扩增产物犃犈犃犵342经犈犮狅犚Ⅰ/犛犪犾Ⅰ双酶切,犜4犇犖犃连接酶连接于经上述双酶切的狆犅犞220载体,转化大肠杆菌犇犎5α.抽提质粒,经犈犮狅犚Ⅰ/犛犪犾Ⅰ双酶切鉴定重组子,阳性重组子送上海生工公司测序.1.5重组基因工程菌的诱导表达将筛选的阳性重组子转化大肠杆菌犅犔21,挑取单菌落,接种于含犃犿狆(100μ犵/犿犔,下同)的犔犅培养基中,30℃振荡培养过夜.次日按1%接种于新的犃犿狆+培养基培养至犃600狀犿达0.4~0.6时迅速升温至42℃继续培养.分别于0,2,4,6犺取样,同时以空载体菌诱导为对照,10%犛犇犛-犘犃犌犈.1.6目的蛋白表达形式的鉴定收集诱导表达的重组菌,冰浴超声破菌:200犠,30狊,间隔15狊,全程15犿犻狀.12000×犵离心收集上清和沉淀,10%犛犇犛-犘犃犌犈,分析目的蛋白表达形式.沉淀分别经3犿狅犾/犔尿素和1%犜狉犻狋狅狀-100洗涤,再溶于含8犿狅犾/犔尿素的犜狉犻狊-犆犾缓冲液(狆犎8.0)过夜.1.7重组蛋白的纯化和复性将溶解的包涵体上犇犈犃犈柱,收集穿透峰,0.6犿狅犾/犔犖犪犆犾梯度洗脱,时间2犺.收集各峰,犛犇犛-犘犃犌犈分析.将穿透峰狆犎值调至6.5,上犆犕柱,0.6犿狅犾/犔犖犪犆犾梯度洗脱,时间2犺,收集穿透峰和洗脱峰,犛犇犛-犘犃犌犈检测,薄层扫描鉴定蛋白纯度.将所得目的蛋白用尿素梯度透析复性,最后以狆犎8.0的25犿犿狅犾/犔犜狉犻狊-犎犆犾溶液透析,用犘犈犌20000浓缩.1.8犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋分析将复性后的重组蛋白犃犈犃犵342进行10%犛犇犛-犘犃犌犈,电转移至硝酸纤维膜上,以5犵/犔脱脂奶粉封闭2犺.分别以甲肝及戊肝患者阳性血清及健康人血清为一抗,犎犚犘标记的羊抗人犐犵犌为二抗,进行重组蛋白的免疫印迹分析.2实验结果2.1犃犈犃犵342基因的扩增经重叠延伸犘犆犚扩增得到的犃犈犃犵342基因片断长度约为1049犫狆,与预期大小一致.2.2狆犅犞220-犃犈犃犵342的克隆和筛选将犘犆犚扩增的目的片断克隆于狆犅犞220载体后,经犈犮狅犚Ⅰ和犛犪犾Ⅰ双酶切鉴定,证明目的片断已克隆至狆犅犞220载体上,见图1.2.3犇犖犃序列测定将阳性重组子送上海生工公司测序,其结果表明插入重组表达质粒狆犅犞220的犃犈犃犵342序列与预期一致,读码框架正确.2.4重组工程菌的诱导表达及表达方式的鉴定收集诱导前后的细菌及超声破菌的上清和沉淀,进302第2期奎翔等:甲/戊型肝炎病毒重组抗原基因的克隆及表达行犛犇犛-犘犃犌犈全菌体电泳,结果显示在分子质量36犽狌处有明显新蛋白带,表明重组的工程菌能表达外源目的蛋白.凝胶经薄层扫描分析,表达蛋白占细菌总蛋白的20%,分子质量约为36犽狌,与预期相符.诱导菌体经超声破菌后,犛犇犛-犘犃犌犈电泳分析,目的蛋白主要以包涵体形式存在,见图2.2.5重组蛋白的纯化及复性经犇犈犃犈柱和犆犕柱纯化后的重组蛋白犃犈犃犵342在分子质量36犽狌处有1条带,薄层扫描,其纯度达90%,见图3.2.6犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋鉴定检测结果显示,重组蛋白犃犈犃犵342与甲肝及戊肝患者阳性血清有良好的免疫反应,而与阴性血清不发生反应,见图4.1:犇犖犃分子量标准;2:犎犃犃犵148;3:犎犈犃犵185;4:犃犈犃犵342;5:犈犮狅犚Ⅰ和犛犪犾Ⅰ双酶切重组质粒狆犅犞220-犃犈犃犵342图1狆犅犞220-犃犈犃犵342酶切鉴定犉犻犵.1犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犿犪狆狅犳狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋狆犾犪狊犿犻犱狆犅犞220-犃犈犃犵3421:蛋白分子质量标准;2:42℃诱导6犺的空载体菌株;3~6:42℃分别诱导0,2,4,6犺的重组犈.犮狅犾犻;7,8:重组犈.犮狅犾犻42℃诱导6犺后的超声上清和沉淀图2犛犇犛-犘犃犌犈检测目的蛋白表达犉犻犵.2犛犇犛-犘犃犌犈狆狉狅犳犻犾犲狅犳犲狓狆狉犲狊狊犲犱犃犈犃犵342狆狉狅狋犲犻狀1:蛋白分子质量标准;2:溶于8犿狅犾/犔尿素的包涵体;3:经犇犈犃犈-犛犲狆犺犪狉狅狊犲离子交换层析纯化的目的蛋白;4:经犆犕-犛犲狆犺犪狉狅狊犲离子交换层析纯化的目的蛋白;5:复性浓缩后的犃犈犃犵342图3犃犈犃犵342的纯化及复性犉犻犵.3犘狌狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱狉犲狀犪狋狌狉犪狋犻狅狀狅犳犃犈犃犵3421,3,5:蛋白分子质量标准;2:人抗犎犃犞阳性血清与犃犈犃犵34反应;4:人抗犎犈犞阳性血清与犃犈犃犵342反应;6:阴性血清与犃犈犃犵342反应图4犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋检测犃犈犃犵342与犎犃犞/犃犈犞患者阳性血清的免疫反应性犉犻犵.4犠犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋狅犳犃犈犃犵342狑犻狋犺犺狌犿犪狀-犪狀狋犻-犎犃犞/犎犈犞狆狅狊犻狋犻狏犲狊犲狉犪402云南大学学报(自然科学版)第30卷3讨论到目前为止,国内还没有商业化的戊型肝炎疫苗和相关的二价疫苗问世,研究表明戊型肝炎疫苗的中和表位主要位于犗犚犉2的羧基末端[2].犜狊犪狉犲狏等用昆虫杆状病毒表达系统表达犎犈犞犗犚犉2的犪犪112~660片段时,发现目的蛋白在表达过程中被剪切为55犽狌蛋白(犪犪112~607)和53犽狌蛋白(犪犪112~578),并且可以形成类病毒颗粒结构,具有良好免疫原性[7].董晨、葛胜祥等分别在原核中表达了犗犚犉2犆端片断(犪犪452~617和犪犪368~606),均能形成犞犔犘[8,9],与55犽狌蛋白相比,犆端几乎完全重叠,而犖端缺失,说明犗犚犉2犆端是形成犞犔犘的关键区域.由于犞犔犘疫苗通常易于被抗原呈递细胞(犃犘犆)吞噬呈递,从而诱导较强
本文标题:甲/戊型肝炎病毒重组抗原基因的克隆及表达
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