第三章-核酸扩增技术课件

目录第三章核酸扩增技术PolymeraseChainReactiontechniques目录大纲要求：掌握PCR的原理和反应过程掌握PCR反应体系掌握PCR产物的检测熟悉实时荧光定量PCR的原理和方法了解以PCR为基础的相关技术Special目录二、教学内容第一节聚合酶链式反应第二节以PCR为基础的相关技术第三节PCR产物的检测第X节实时荧光定量PCR现在位置P169目录基础知识遗传中心法则现在位置P169DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制目录+基础知识目录基础知识目录DNA加热变性DNA冷却复性一、核酸分子杂交的基本原理基础知识目录DNA变性(denaturation)定义：在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。基础知识目录基础知识目录融解温度（Tm）定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。基础知识meltingtemperature，目录DNA复性定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。基础知识目录基础知识目录基础知识dNTPdATPdCTPdGTPdTTPdNTP目录PCR概念：在体外特异地复制一段已知序列的DNA片段的过程。第一节聚合酶链式反应现在位置P169目录一、PCR的原理和反应过程PCR反应重复进行DNA复制的过程，使DNA得以扩增，每一次复制包括3个步骤：变性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）现在位置P125目录变性（denaturation）将待复制的双链DNA经加热至94℃～95℃）左右一定时间后，DNA双螺旋的氢键断裂，使之成为单链分子，作为反应的模板（template)，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；现在位置P170目录退火（annealing）温度降低至寡核苷酸（oligonucleotide）引物的融点温度以下（40～70℃），使引物能与模板互补结合，形成杂交链；现在位置P125目录延伸（extension）将温度升至72℃左右，使反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3’端，使杂交双链不断延伸，以至形成新的DNA双链。现在位置P125目录PCR的基本反应过程变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C现在位置P170（40-70˚C）目录PCR的扩增效率现在位置P170循环次数：0123…n产物数量：2222…20123n每一次循环后，一分子模板被扩增为两个分子每个循环所产生的DNA片段，即为下一个循环的模板PCR产物量以指数形式增长目录1.模板DNA2.特异性引物3.耐热DNA聚合酶4.dNTPs5.Mg2+二、PCR体系基本组成成分现在位置P170目录1.模板DNA2.特异性引物3.耐热DNA聚合酶4.dNTPs5.缓冲液二、PCR体系基本组成成分现在位置P170目录模板(template)模板就是将要被复制的核酸片段，包括基因组DNA、RNA、质粒DNA和线粒体DNA等。在用RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为PCR反应的模板进行扩增反应。现在位置P125目录耐热DNA聚合酶TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）是从一种生活在热泉（80～90℃）中的水栖噬热菌（Thermusaquaticus）中提取的，有很高的耐热稳定性。TaqDNA聚合酶的作用是催化DNA合成，即在模板指导下，以dNTP为原料，在引物的3’-OH端,加上dNTP,在二者间生成3’，5’-磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸。现在位置P170目录dNTPs即dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种脱氧核苷三磷酸的混合物。反应体系中4种核苷酸的浓度必须一致四种核苷酸间浓度的不平衡会增加反应时DNA聚合酶错配的机率。浓度过高会加快反应速度，但导致非特异性扩增降低在dNTP浓度会提高反应的特异性一般为20~200umol/L现在位置P170目录镁离子浓度镁离子浓度在扩增反应中是一个至关重要的因素，因为镁离子对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高TaqDNA聚合酶的活性有直接的影响。Mg2+浓度过低使酶活力降低Mg2+浓度过高又会使酶催化非特异性扩增。一般为1.5mmol/L现在位置P172目录引物(Primer)引物是化学合成的已知序列的寡核苷酸(oligonucleotide)分子。引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。现在位置P170目录引物设计时必须遵循的原则（6条）1.用于PCR反应的引物需要二条，分别设在被扩增目标片段的二端，并分别与模板正负链序列互补。2.引物的长度一般以18～25个核苷酸为宜①引物过长容易产生寡核苷酸的链内互补，形成发夹状结构，②引物过短则会降低扩增的特异性；现在位置P171目录引物设计时必须遵循的原则3.二条引物之间（尤其在3’端）的序列不可有互补，以免形成引物二聚体；4.引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积。①C＋G的比例一般为45~55%。现在位置P171目录5.PCR扩增中的退火温度是根据引物的Tm值而决定的，二条引物的Tm值不能差别太大。6.根据需要，合成引物时在其5’端可以加修饰成分如加入酶切位点，用生物素、荧光素、地高辛等标记，引入突变位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等。现在位置P171引物设计时必须遵循的原则目录三、反应条件1、温度①变性温度：一般把变性温度定在95～97℃之间，以使模板DNA和产物双链完全打开。②退火温度：退火温度决定PCR反应的特异性，退火温度的设定取决于引物的Tm，通常PCR的退火温度应低于引物Tm5℃左右。③延伸温度：一般为72℃，在这个温度下TaqDNA聚合酶具有较高的酶促活性，有利于DNA的复制。现在位置P172目录2、时间PCR循环中每个步骤所需的时间取决于所扩增片段的长度。以长度为200～1000bp的扩增片段为例，循环中变性、退火和延伸三个步骤的持续时间一般均为30秒～1分钟。在模板（尤其是基因组DNA）进行第1次变性时应给予足够长的时间（5～7分钟，根据变性温度高低而异）以使模板彻底变性，然后再进入循环。时间过长会降低扩增的特异性。现在位置P173目录3、循环次数循环次数一般为20～45次。PCR扩增效率呈S型曲线，有平台效应平台效应的原因：初始模板量引物二聚体和反应产物抑制扩增反应体系的组份被消耗引物与模板DNA间竞争现在位置173目录四、PCR技术的质量控制硬件方面实验室规范化设置软件方面样本采集核酸提取扩增产物分析测定结果的报送现在位置P173目录（一）实验室的规范化设置临床基因扩增检验实验室必须包括四个工作区域：①试剂贮存和准备区；②标本制备区；③扩增反应区；④产物分析区。这四个区域必须互相独立，并严格按照上述顺序设置。每一区域都必须配置专用仪器，所用物品、试剂和耗材不得从某一个区域移至另一个区域使用。现在位置P174目录（二）PCR技术的质量保证PCR技术用于临床检验的质量保证主要涉及基因扩增检验全过程的质量保证、室内质量控制和室间质量评价。现在位置P129目录（二）PCR技术的质量保证样本采集核酸提取扩增产物分析测定结果的报送现在位置P129目录（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析四、PCR的主要用途现在位置P目录第二节以PCR为基础的相关技术目录（一）逆转录PCR技术（二）巢式（三）定量PCR技术（＊＊＊＊＊）（四）多重PCR技术（五）PCR诱导定点突变（六）原位PCR技术（七）差异显示PCR技术（X）免疫PCR技术现在位置P174以PCR为基础的相关技术目录（一）、逆转录PCR逆转录PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）是以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。由于耐热的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作为模板，因此首先必须将总RNA或mRNA作逆转录，以生成与之互补的cDNA，然后再以cDNA作为模板进行PCR扩增，得到所需的目的基因片段。RT-PCR主要用于克隆cDNA、合成cDNA探针、检测RNA病毒和分析基因表达等。现在位置174目录（二）、巢式PCR巢式PCR（nestedPCR）是对靶基因进行二次扩增。二次扩增所用的引物不能相同，第二次扩增所用的引物必须位于第一次扩增所用引物的内侧先用第一对引物扩增出一个较大的片段，再用第二对引物进行第二次扩增第二次扩增的模板是第一次扩增的产物现在位置174目录（二）、巢式PCR现在位置174引物1引物2nest要扩增的目标基因目录（三）、定量PCR相对定量PCR定量PCR（实时荧光PCR）现在位置175目录（四）多重PCR技术多重PCR（multiplexPCR）即在同一反应体系中加入多对引物，以同时扩增一份DNA样品中多个不同序列的靶片段。现在位置P179目录（四）多重PCR技术多重PCR必须满足的两个条件：PCR反应条件适合所有被扩增的DNA片段同一反应内各扩增片段的大小应不同，以便检测时能通过电泳将各片段充分分离现在位置P179目录（四）多重PCR技术现在位置P179目录（四）多重PCR技术现在位置P179目录（五）PCR诱导定点突变DNA重组技术使我们能够首先用各种方法对克隆的DNA片段进行突变，在对产生的突变作DNA序列分析以后，再对突变体的特殊功能作进一步研究。现在位置P180目录（六）原位PCR技术（insituPCR）组织固定处理细胞内的DNA或RNA，并以其作为靶序列进行PCR反应的过程称为原位PCR。原位PCR与普通PCR的主要区别在于模板的制备。经脱蜡处理的组织切片或滴加在载玻片上的细胞悬液都可作为扩增样品，所有步骤均在载玻片上进行。现在位置P134目录（六）原位PCR技术（insituPCR）进行PCR时，加入地高辛标记的的dUTP，使扩增产物带有地高辛。PCR结束，加入酶标抗地高辛抗体，再加入底物显色。现在位置P134目录（六）原位杂交PCR原位杂交PCR与原位PCR的唯一区别：扩增结束后，用寡核苷酸探针与扩增产物作原位杂交。现在位置P134目录（七）差异显示PCR（defferentialdisplayPCR,DD-PCR）现在位置P182一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。目录目录（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）结合PCR技术和抗原抗体反应用于检测抗原（蛋白质）固相载体上包被有抗体1抗体2上标记有DNA，作为PCR的模板现在位置P134目录（X）免疫PCR（Immuno-PCR,IPCR）第一步：载体－抗体1-抗原-抗体2－DNA（C－DNA）第二步：C－DNA-PCR现在位置P134目录目录（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）IPCR的灵敏度是ELISA的100-10000倍现在位置P134目录第三节PCR产物的检测DetectionofthePCRproduct目录第三节PCR产物的检测PCR完成以后，必须对扩增产物进行检测有效性和正确性：通过对PCR产物进行电泳分离，观察扩增条带的有无、扩增片段的大小等判断PCR反应的有效性和正确性。PCR产物定量：（专门章节讲）序列是否正确：测序现在位置P185目录一、PCR—限制性片段长度多态性是根据突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计的对PCR产物作限制性片段长度多态性分析的技术。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点二侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。