第35章DNA的重组

2019/8/231基因重组Chapter35DNA的重组Geneticrecombination2019/8/232DNA重组的几种类型及其主要特点了解Holliday模型细菌基因转移的几种方式转座重组及其生物学意义2019/8/233DNA重组（基因重组、遗传重组geneticrecombination基因重排generearrangenment）DNA分子内或分子间遗传信息的重新组合DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能意义：迅速增加群体遗传多样性、区分有利、不利突变、通过优化组合积累有意义的遗传信息参与许多重要的生物学过程（438页）自然界基因转移、重组：基因变异、物种进化的基础繁殖、病毒感染、基因表达、癌基因激活等过程中起重要的作用2019/8/234一、DNA的重组的分类同源重组（homologousrecombination）特异位点重组（site-specific～）转座重组（transpositional～）2019/8/235二、同源重组两条同源区的DNA分子，通过配对、链的断裂和再连接产生片段交换（crossingover）的过程一般性重组（generalrecombination）两个染色体或DNA分子相互交换对等部分的过程双倍体真核生物：减数分裂，非姐妹染色单体交换相对应的区域，产生的单倍体配子包含父母本两方的遗传信息2019/8/2362019/8/2372019/8/238（一）Holliday模型——遗传重组的分子基础1、Holliday结构4条单链形成Holliday结构2、关键步骤1）两个同源染色体DNA排列整齐2）DNA的一条链切断并与另一个DNA对应的链连接3）通过分支移动产生异源双链DNA4）Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA2019/8/2392019/8/23102019/8/2311Holliday中间体2019/8/2312MeselsonMRaddingC修正双链断裂启动重组启动减数分裂2019/8/23133、功能：1）维持种群的遗传多样性2）有助于DNA的损伤修复3）真核生物减数分裂中染色体正确分离到子细胞2019/8/2314(二)细菌的基因转移与重组1、结合作用conjugation结合作用：质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞致育因子（F因子）通过结合作用由F+细胞向F-细胞转移，F质粒约1/3的基因与转移有关，traS和traT基因编码表面排斥蛋白，阻止F+细胞之间的转移，F+细胞的性菌毛与F-细胞结合后收缩，使二者靠近，TraD蛋白构成转移的通道，在TraI在TraY的帮助下结合到转移起点oriT上，切开一条链，使其5΄端进入受体细胞，并合成其互补链，使F-细胞转化为F+细胞，给体细胞中的单链也可以合成互补链。2019/8/2315当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为～2019/8/23162019/8/23172019/8/2318在细菌基因转移的不同时间将配对细胞分开，可以确定基因在染色体上的位置。F质粒DNA可以通过重组整合到受体的染色体中，使受体菌成为高频重组（Hrf)菌株，若F质粒的DNA未能完整地进入受体菌，则受体菌不能转化为F+,F质粒的DNA可以被切割出来，有时可携带宿主菌的染色体DNA，称作F΄因子，F΄因子携带的基因可在受体菌表达。2019/8/2319大肠杆菌染色体的基因图自然条件下感受态的形成需要10多种蛋白质参与通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程——转化2、转化transformation实验室：高浓度的Ca2+处理使细菌形成感受态2019/8/2320分离DNA　SH型肺炎双球菌　RH型肺炎双球菌2019/8/2321普遍性转导：宿主菌任意部位的基因取代噬菌体DNA的一部分转入受体菌3、转导作用transduction通过噬菌体将细菌基因从供体菌转移到受体菌限制性转导：宿主整合部位的DNA取代噬菌体的部分DNA进入受体菌的基因与染色体重组2019/8/2322噬菌体的基因重组2019/8/2323当病毒从被感染的细胞（供体）释放出来，再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组2019/8/23242019/8/23252019/8/23264、细胞融合细胞质膜融合导致基因转移、重组实验室：溶菌酶除细菌细胞壁，人工促使原生质体融合，引起广泛的重组。2019/8/2327RecA蛋白：多功能蛋白1.NTP酶活性：存在单链DNA时，RecA具水解ATP/dATP活性，促进联会2.单链DNA结合活性：RecA蛋白与单链DNA形成丝状复合物，使其免受核酸酶攻击3.DNA解旋活性：单链切口处解开双螺旋4.DNA分子间联会:部分单链DNA区(三)重组有关的酶2019/8/2328溶解酶（Resolvase）活性断裂Holliday结构的交联桥，完成重组RecBCD：2019/8/2329依赖RecBCD起始的重组模型:RecBCD有依赖ATP的核酸外切酶、核酸内切酶和解螺旋酶活性，当DNA断裂时，它结合在其游离端，使其解旋并降解，直至酶移动到chi位点（GCTGGTGG)，在其3＇侧4-6核苷酸处将链切断，产生3＇游离单链，随后单链与RecA结合，开始同源区重组。2019/8/2330RecA蛋白的丝状聚合体与DNA的相互作用RecA蛋白的带状图解RecA蛋白的丝状聚合体，每一圈螺旋由6个RecA蛋白单体构成，其中一个单体由红色标出。2019/8/2331RecA蛋白引起DNA同源重组的模型2019/8/2332在大肠杆菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白参与的同源重组。（a）RuvA四聚体的图解。四个亚基形成的结构像四个花瓣的花。（b）RuvA/RuvB的作用：（左）RuvA四聚体结合到Holliday位点；（中）RuvB六聚体结合到杂合双螺旋的两对面，DNA穿过其中心，RuvB六聚体的作用像马达，促进超螺旋分叉点通过复合体移动。（右）RuvC结合到Holliday位点，由其核酸酶活性切断核酸链，切割位点由剪切体辨认。（c）RuvA四聚体的电荷分布，蓝色表示正电荷，红色表示负电荷，注意正电荷位于四聚体的表面，有四个负电荷区域位于其中心。（d）假设的RuvA四聚体与Holliday位点结合的结构模型。2019/8/2333三、特异位点重组原核生物中，有时基因重组依赖于小范围的同源序列的联会，重组只限于该小范围内，只涉及特定位点的同源区，这类重组称作～由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合2019/8/23341、λ噬菌体DNA的整合与切除噬菌体的整合酶识别噬菌体DNA和宿主染色体的特异靶位点，而后发生的选择性整合2019/8/2335通过attP和attB间的相互重组，环状的噬菌体DNA转换为整合的原噬菌体，原噬菌体通过attL和attR间的相互重组而切除2019/8/23362、细菌的特异位点重组沙门氏菌两种鞭毛蛋白表达的调控2019/8/23373、免疫球蛋白基因的重组IgG的分子结构2019/8/2338（1）（2）（3）（4）（5）2019/8/2339重组位点有7和9nt的信号序列,中间间隔12或23bp。2019/8/2340免疫球蛋白基因重组的模型重组酶（RAC1/RAC2)复合体与重组信号序列结合复合体使编码序列与重组信号序列之间的双连断裂，编码序列的末端形成发夹结构。重组信号序列结合形成环状结构。编码序列连接前经过加工，连接位点不十分确定，增加了免疫球蛋白的多样性。DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)和DNA连接酶参与了加工和连接过程。9碱基序列7碱基序列2019/8/2341在不同的核苷酸位点重组可以生成不同的蛋白质2019/8/2342四、转座重组（transposition）McClintock的重要发现2019/8/23431950，麦克林托克，玉米籽粒颜色遗传，存在着一种转座因子（transposableelements）控制籽粒颜色，这些因子可在染色体上移动，控制着某些基因表达70年代，夏皮罗（Shapiro），E.coli乳糖操纵子突变株，进行杂交分析，确认转座子的存在。存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位称为转座子2019/8/2344大多数基因在基因组内的位置是固定的有些基因可以从一个位置移动到另一位置可移动的DNA序列包括插入序列和转座子由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为～2019/8/2345转座子移位：导致DNA链的断裂/重接or某些基因启动/关闭。引起：a.插入突变；b.产生新的基因；c.染色体畸变；d.生物进化，遗传效应。转座子：原、真核细胞与同源染色体重组相比，转座子作用频率低得多，构建突变体有重要意义2019/8/2346插入序列转座插入序列（insertionsequences，IS）：750～1500bp反向重复序列：9～41bp，位于两侧转座酶编码基因：产物引起转座，位于中间正向重复序列：4～12bp，位于反向重复序列外侧插入序列特有组成：转座酶基因2019/8/2347保守性转座：从原位迁至新位复制性转座：插入序列复制后，一个复制本迁到新位，另一个保留在原位方式2019/8/23482019/8/23492019/8/2350转座子转座转座子（transposons）：可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列组成反向重复序列转座酶基因特殊基因：如抗生素抗性基因等转座酶基因特殊基因2019/8/2351转座子具有反向末端重复序列以及在靶部位两侧产生的同向重复序列。在该例中靶序列为5bp，转座子末端由9bp反向重复序列组成，数字1-9指序列重复碱基对。*两侧正向重复***末端反向重复**(一)细菌的转座因子1.插入因子2019/8/23522.组合型转座子：两个插入序列之间夹着一段序列（如抗性基因）。两个插入序列可以同向或反向排列，有时均有转座活性，有时只有一个有转座活性。3.复合型转座子：插入序列被转座酶基因取代，图示为Tn3(TnA家族）的结构。两端为38bp的反向重复，其两侧为5bp的靶序列，tnpA编码转座酶，tnpR编码的蛋白质可以作为解离酶（使转座子与受体DNA形成的共整合体重组和解离），也可以作为阻遏蛋白调节tnpA和tnpR两个基因的表达，res为解离的控制位点，TnpR蛋白结合于其上发挥调控作用。2019/8/23534.转座的方式转座子可用不同的方式转座，转座因子插入基因后可使基因失活，也可引起染色体的断裂、重复、缺失、倒位、易位等变化。两个IS10组件构成一个复合转座子，它能使位于他们之间的任何DNA易位。当Tn10是一个小的圆形分子的一部分时，IS10重复序列可转座至环状分子的任一侧。2019/8/2354插入序列使靶序列的数量增加，在插入序列两侧各有一个。2019/8/2355复制转座作用产生了转座子的一个拷贝，它插入到一个接受位点。给予位点保持不变，给予者和接受者都有转座子的一个拷贝。2019/8/2356非复制转座作用在未被修复的情况下，可能造成致死突变。2019/8/2357保守的转座作用不造成核苷酸的丢失，如λ噬菌体的整合和切除。2019/8/2358转座子引起DNA的重排，正向重复序列的重组引起其间序列的切除或插入。2019/8/2359反向重复序列的重组能引起其间序列反向排列。2019/8/2360转座作用可引起给体和受体的整合或分割，并可引起转座子拷贝数的增加2019/8/2361(二)真核生物的转座因子原核生物的转座酶主要作用于产生它的转座因子，表现出顺式显性。真核生物的转座酶可以作用于任何末端具有该酶所识别的反向重复顺序的DNA,使其转移到相应的靶位点。在玉米的激活-解离系统（activator-dissociation