第九章—核酸分子杂交(上)-周琳

核酸分子杂交技术NucleicAcidMolecularHybridization主讲内容核酸分子杂交的基本原理核酸探针核酸分子杂交技术一、DNA的变性（denaturation）变性：在一定的条件下，DNA双螺旋之间的氢键断裂，解离成两条无规则的卷曲状单链DNA分子，此现象称为变性。复性：去除变性因素后，单链DNA通过碱基互补配对原则重新结合成稳定的双螺旋结构，这一过程称为复性。二、DNA的复性(renaturation)退火淬火根据核酸变性和复性的原理，来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补配对形成异源双链杂交体的过程。三、核酸分子杂交杂交的基础：核酸分子单链之间的碱基互补配对。注：分子杂交可以在DNA与DNA、RNA与RNA、RNA与DNA的两条单链之间进行。核酸分子的浓度温度离子强度核酸分子的复杂性影响核酸分子杂交的因素四、核酸分子杂交技术通过标记的单链核酸探针与固相支持物上或液相中单链的互补靶序列退火形成双链杂交体，而定性或定量检测特异DNA或RNA的技术。第二节核酸探针核酸探针的概念核酸探针的类型核酸探针的标记核酸探针的检测方法核酸探针(nucleicprobe)：指能够与待测的靶核酸片段互补结合的带有特殊可检测标记的核苷酸片段。一、概念按化学本质分：DNA探针RNA探针按标记物分：放射性标记探针非放射性标记探针按分子大小分：寡核苷酸探针单链探针双链探针二、核酸探针的类型二、常见核酸探针1.基因组DNA探针2.cDNA探针3.RNA探针4.寡核苷酸探针来源于某种生物的基因组，为某一基因的全部或部分序列。来源于cDNA,不含有内含子序列，适用于基因表达研究。大多以单链形式存在,杂交效率高。可通过体外转录技术获得。用化学合成技术在体外合成的单链DNA,长度一般为20-50bp。三、核酸探针的标记1.核酸探针的标记物（1）放射性核素标记物常用放射性核素标记物有：32P、35S、3H优点：①灵敏度极高,可检测到10-14～10-18g的物质，在最适条件下，可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量，光谱分析法只能鉴定10-9g的物质。②对碱基配对的特异性和稳定性无影响。③特异性高。缺点：放射性污染，有半衰期。32P或35S同位素标记的单核苷酸（α）（γ）（OH）HOH(2)非放射性标记物优点：无放射性污染，稳定性好，可以较长时间存放，处理方便。缺点：灵敏度、特异性不够理想。常用非放射性标记物有：生物素、地高辛、酶、荧光素2.核酸探针的标记方法（一）酶促法•缺口平移法•随机引物法•DNA探针末端标记法（二）化学法预先标记酶促反应转移探针（1）缺口平移法（nicktranslation）由DNA酶Ⅰ和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。酶促法随机引物：含有各种可能排列顺序的六核苷酸片段的混合物。（2）随机引物法（randompriming）酶促法在5’或3’端通过酶促反应加上标记物•DNA聚合酶ⅠKlenow片段3’末端标记法•T4多核苷酸激酶5’末端标记法•聚合酶链反应标记DNA探针•RNA探针的标记•寡核苷酸链探针的标记（3）探针的末端标记酶促法ⅠDNA聚合酶ⅠKlenow片段3’末端标记法限制性内切酶酶促法ⅡT4多核苷酸激酶5’末端标记法ATPADPγ32PT4多核苷酸激酶碱性磷酸酶酶促法1.生物素地高辛标记核酸探针2.酶、荧光素标记核酸探针化学法生物素化核苷酸①生物素(biotin)标记生物素-16-dUTP光敏生物素标记法强光10-20分钟光敏生物素的结构②地高辛(digoxigenin)标记Dig-11-dUTP的结构③酶标记•碱性磷酸酶•辣根过氧化物酶④荧光素标记异硫氰酸荧光素（FITC）荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架结合四、核酸探针的检测核酸分子杂交反应完成后，必须使已标记的核酸探针显示出可检测信号，方能检测未知的待测核酸序列。1.放射性同位素标记探针的检测2.非放射性标记探针的检测1.放射性同位素标记探针的检测（1）放射自显影：利用放射线在X线底片的成影作用来检测杂交信号。（2）液体闪烁计数器：2.非放射性标记探针的检测（1）直接检测：杂交反应后可以立刻观测结果。如酶和荧光素直接标记的探针。（2）间接检测：反应结果不能被直接检测,需经两步反应：①与可检测系统偶联的偶联反应，②显色反应。（1）直接检测法①碱性磷酸酶显色体系②辣根过氧化物酶显色体系酶促显色法荧光法Dig-DNA探针+抗Dig抗体-碱性磷酸酶（或辣根过氧化物酶）+底物（2）间接检测法①偶联反应②显色反应酶法：通过酶促反应使其底物形成有颜色的反应产物碱性磷酸酶辣根过氧化物酶DAB（二氨基联苯胺）→红棕色TMB（四甲基联苯胺）→蓝色第三节核酸分子杂交技术印迹杂交核酸原位杂交液相印迹杂交固相杂交是将电泳分离的待测DNA片段固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的位置上显示杂交信号的方法。一、传统的核酸分子杂交技术1、Southern印迹杂交提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性转移到NC膜，高温烘烤与DNA探针杂交放射自显影基本步骤预杂交图虹吸印迹法与SouthernBlotting不同的是：1.不需要限制性核酸酶切;2.变性方法不是碱变性，而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞等方法。检测靶分子为RNARNA极易被环境中存在的RNase降解，提取时要特别注意RNase污染问题。2、Northern印迹杂交3、斑点杂交与狭缝杂交将RNA或DNA变性后直接点样或用狭缝点样器加样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再用探针进行杂交，这样的方法称为称为斑点杂交（dotblotting）或狭缝杂交(slotblotting)。dotblottingslotblotting4、Western免疫印迹检测蛋白质