Agilent1100高效液相色谱仪操作规程

Agilent1100高效液相色谱仪操作规程操作说明：1.开机前准备：1.1仪器设备：Agilent1200LC●G1322A(在线脱气机)。●G1311A(四元泵)。●G1329A（标准型自动进样器）。●G1316A（柱温箱）。●G1315A（DAD检测器）。●色谱柱1.2溶剂准备：●有机相必须是色谱级纯。●水相必须是二次蒸馏水或用二级蒸馏水配置的缓冲盐溶液、酸碱溶液。●流动相使用前必须过0.45μm的微孔滤膜。有机相和水相微孔滤膜的选择参考下表。产品类别代表产品品系产品特点纤维素酯类混合纤维素膜（CN-CA）水相成孔性能好，亲水性好，材料成本低。可耐稀酸。不适合于酮类、酯类、强酸、强碱类液体过滤。聚酰胺类尼龙6（PA-6）通用具有亲水性，较耐碱不耐酸。在酮、酚、醚及高分子醇类不被腐蚀。聚砜类聚砜（PS）通用良好的化学和热稳定性，耐辐射，机械强度高。聚偏氟乙烯/聚四氟乙烯膜PDEF/PTFE有机PDEF耐化学腐蚀，耐氧化，耐高温，疏水性（酒精处理后变清水性），PTFE耐酸碱性强。聚烯烃类聚丙烯膜（PP）有机具有良好的化学稳定性，耐酸碱和各种有机溶剂。价格便宜，但孔径分布宽。无机材料陶瓷、玻璃BP、金属膜通用耐高温，耐有机溶剂、耐生物降解等。2.基本操作步骤:(一)、开机：1、打开计算机,进入中文WindowsXP画面,并运行CAGBootpServer程序（部分安装程序不需要运行Bootp）。2、打开1200LC各模块电源。3、待各模块自检完成后，双击“仪器1联机”图标，化学工作站自动与1200LC通讯，进入的工作站画面如下所示。4、从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面,点击“视图”菜单中的“仪器实际值”，“在线光谱”，“化学工作站状态”，“系统视图”,“样品视图”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。5、把流动相放入溶剂瓶中。6、打开冲洗阀。7、点击“泵”图标，点击“设置泵…”选项，进入泵编辑画面。8、设流速：5ml/min，点击“确定”。9、点击“泵”图标，点击“控制…”选项，选中“启动”，点击“确定”，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。10、点击“泵”图标，点击“控制…”选项，选中“关闭”，点击“确定”关泵，关闭冲洗阀。11、点击“泵”图标，点击“设置泵…选项”，设流速：例如1.0ml/min。12、点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积，点击“确定”。13、点击“泵”图标，点击“泵辅助设定…”，设定“最流速梯度”，“最小冲程”，“压缩因子”，“主通道”。（二）、数据采集方法编辑：1、开始编辑完整方法：●从“方法”菜单中选择“编辑完整方法…”项，如下图所示选中除“数据分析”外的三项，点击“确定”，进入下一画面。2、方法信息：●在“方法注释”中加入方法的信息（如：测试方法）。●点击“确定”，进入下一画面。3、泵参数设定：（以四元泵为例）●在“流速”处输入流量,如1ml/min，在“溶剂B”处输入80.0,(A=100-B-C-D),也可“插入”一行“时间表”,编辑梯度。在“压力限”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。●点击“确定”，进入下一画面。4、自动进样器参数设定:（以标准G1329A为例）●选择合适的进样方式,如图所示，进样体积5.0ul,洗瓶位置为6号。“标准进样”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“洗针进样”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“使用进样器程序”---可以点击“编辑”按钮进行进样程序编辑。●“最优化”有“无”，“重叠进样周期”和“预取进样瓶”，可以根据实际情况选择。●点击进“确定”，进入下一画面。5、柱温箱参数设定:●在“温度”下面的空白方框内输入所需温度,如：40度。并选中它,点击“更多”键,如图所示,选中“与左侧相同”，使柱温箱的温度左右一致。●点击“确定”，进入下一画面。6、检测器参数设定:6.1、VWD检测器●在“波长”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm,在“峰宽(响应时间)”下方点击下拉式箭头,选择合适的响应时间,如0.1min(2s)。●在“时间表”中可以“插入”一行，输入随时间切换的波长，如1min，波长=300nm。点击“确定”，进入下一画面。6.2、DWD检测器7、在“运行时选项表”中选中“数据采集”，点击“确定”。8、点击“方法”菜单，选中“方法另存为…”，输入一方法名，如“测试”，点击“确定”。9、从菜单“视图”中选中“在线信号”,选中“信号窗口1”,然后点击“改变…”钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击“确定”。(如同时检测二个信号,则重复此操作,选中“信号窗口2”。10、点击“确定”,从“仪器”菜单选择“系统开启”。（三）、序列的设置1、从“序列”菜单中，打开“序列表…”，光标至于“行1”，单击“剪切”，去除“行1”，再单击“插入/批量输入向导”。2、设置“操作”为“追加”，“开始位置”为“1”，“插入行数”为所单击“改变”键，即可弹出右侧的“编辑信号图谱”窗口，进而选择所需的谱图信号。需的样品数，如“3”，“方法名称”为“测试”，“样品名称”为“排毒清脂片”，“进样次数”为“3”，“样品类型”为“样品”或“标准物质”“质控物质”，点击“确定”：3、光标至于“行3”、单击“追加一行”，设置冲洗仪器和色谱柱的样品和方法，“方法名称”选择已经设置好的“水醇洗柱”。4、单击“确定”，完成序列设置。5、从“序列”菜单中，打开“序列参数”选项，如下图所示，输入操作者名称，如“安装工程师”；在“数据文件”中选择“手动”或“前缀/计数器”，单击“确定”，完成设置。6、从“序列”菜单中，打开“保存序列”选项，输入“文件名”，如“测试”，单击“确定”，完成设置。7、等仪器准备好，基线平稳，从“运行控制”菜单中选择“运行序列”，进样（或者从操作界面上点击“开始”，进样）。(若无自动进样器，则基线平稳后，进样并搬动手动进样阀，启动运行。)（DAD,VWD色谱图如下所示：）（四）、数据分析方法编辑:1、从“视图”菜单中，点击“数据分析”进入数据分析画面。2、从“文件”菜单选择“调用信号”，选中您的数据文件名，如下图所示。点击“确定”，则数据被调出。3、做谱图优化：从“图形”菜单中选择“信号选项”，如下图所示。从“范围”中选择“满量程”或“自动量程”及合适的时间范围或选择“自定义量程”调整。反复进行，直到图的比例合适为止。点击“确定”。4、积分:●从“积分”菜单中选择“积分事件”选项，如下图所示。选择合适的“斜率灵敏度”，“峰宽”，“最小峰面积”，“最小峰高”。●从“积分”菜单中选择“积分”选项，则数据被积分。●如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。●点击左边“√”图标，将积分参数存入方法。5、打印报告:●从“报告”菜单中选择“设定报告”选项，进入如下图所示画面。●点击“定量结果”框中“计算”右侧的黑三角，选中“面积百分比”，其它选项不变。●点击“确定”。●从“报告”菜单中选择“打印报告”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则点击“报告”底部的“打印”钮。(四)、关机:●关机前，先关灯，并必须用相应的溶剂充分冲洗系统。●退出化学工作站，依提示关泵，及其它窗口，关闭计算机。●关闭Agilent1200各模块电源开关。(五)、Agilent1200LC维护保养：1、色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如乙腈/甲醇适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）。2、手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口。3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。4、带seal-wash的1200，要配制90%水+10%异丙醇，开启seal-wash清洗泵，溶剂不能干涸。5、注意事项见说明书，或由现场工程师介绍。(六)、维护知识问答1、为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项.清洗液配制:90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力，不能干涸。3、为什么Agilent1200LC的流动相管路非常细?在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4～5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1～2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，Agilent1200LC使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。毛细管线分类：0.17mm内径------绿色;0.12mm内径-------红色。PEEK管线：内径-----0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。毛细管线优点:柔韧性好.***Agilent公司同时备有1/16in的粗外径毛细管线,适用于不同习惯的用户,优点是刚性好,但柔韧性差一些。4、流动相使用前为什么要脱气？流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。常用的脱气方法比较：氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。在线真空脱气法：Agilent1200LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=4—7）。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。A：请严格执行溶剂过滤。B：请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液C：如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001---0.001M的叠氮化钠.D:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。E：避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。6、Agilent1200LC泵如何维护？Agilent1200LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的流动相，及时合理的维护非常重要。A：流动相使用前请必须脱气、过滤。B：使用缓冲盐时，要加在线Seal-wash选项。C：关机前，用相应的溶剂充分冲洗系统。D：及时更换PurgeValve内的过滤芯。（当打开PurgeValve时，压力高于10bar，表明过滤芯已堵）。E：使用合适的密封圈。7、如何选择合适的泵头活塞密封圈？泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用，但使用正相溶剂（如正己烷），不适合使用标准活塞密封圈，特别是长时间使用时，需更换另一种不同的密封圈，我们建议使