第六讲-杂交技术

分子杂交技术MolecularHybridization第一节杂交的基本原理一、核酸分子杂交的基本原理与分类（一）核酸分子杂交的基本原理1、变性（denaturation）（1）定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。（（22））..引起核酸变性的因素引起核酸变性的因素酸碱热变性剂（尿素）有机溶剂（乙醇）（3）、变性核酸的特点：粘度下降沉降速度增加浮力上升紫外吸收增加2、Tm,融解温度(MeltingTemperature)：定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。影响影响TmTm的因素：的因素：（（11））DNADNA碱基的组成碱基的组成GG--CC含量越多含量越多TmTm值越高值越高AA--TT含量越多含量越多TmTm值越低值越低（2）溶液的离子强度低离子强度Tm值越低高离子强度Tm值越高（3）pH值pH值5-9Tm值变化不明显pH4pH11不利于氢键形成（4）变性剂干扰碱基堆积力和氢键的形成3、复性(Renaturation)变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。影响复性速度的因素：DNA浓度DNA片段的大小DNA片段复杂性合适的复性温度适当的离子强度4、杂交定义定义两条来源两条来源不同不同，但具有，但具有互补互补序列的核酸，按碱基配序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，对原则复性形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分子这个过程即杂交，或称分子杂交。杂交。分类分类DNADNA--DNADNADNADNA--RNARNARNARNA--RNARNA二、核酸探针（一）探针的概念探针（probe）指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。基因探针指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。（二）探针种类和选择1.探针种类（1）基因组DNA探针为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。（2）cDNA探针以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。（3）RNA探针以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。具高杂交效率，但易于降解和标记方法复杂。（4）寡核苷酸探针2.探针的选择高度特异性，一般探针越长，杂交作用越强，其专一性也越强。三、探针标记原理与方法理想的探针标记物应具备①高度的敏感性②标记物与探针结合后，不影响杂交时碱基配对及探针分子的主要理化性质；③检测方法除有高灵敏性、高特异性、假阳性低外，尚需考虑环境污染少，价格低；④若用酶促方法标记，应对酶的Km值影响不大，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性。（一）、标记物放射性同位素标记物非放射同位素标记物1.放射性同位特点：●放射自显影技术检测，信号的强弱通过计数银粒的多少易于进行定量分析。优点：灵敏度高，特异性极强。主要缺点：射线对人体有伤害放射性物质需特殊的处理半衰期短不宜存放使用2.非放射性标记物常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、荧光素。特点：敏感性不如同位素标记稳定性和分辨率高检测时间短操作简便不需特殊的防护设备不存在放射性污染缺点：操作方法复杂，显示过程环节多，易出现杂交信号弱。（二）放射性同位素标记法探针标记法酶反应法化学反应法常用标记探针的同位素32P3H35S131I125I14C探针标记方式标记1、随机引物法（randompriming）利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。将6-8寡核苷酸片段与已变性的DNA单链或RNA模板退火，使该片段随机互补结合在单链分子上，在大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段作用下，以同位素标记的dNTP为原料，寡核苷酸为引物的3’-OH端开始沿5’至3’方向，合成一条与模板互补的新DNA链。2、切口平移法◆胰DNA酶I在DNA双链上随机切开若干切口，切口处形成3’-OH末端。◆大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用，以另一条DNA链为模板。◆4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移。生成的两条链都被同位素均匀标记。3.末端标记法末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5’端或3’端的一类标记法。5’端标记法3’端标记法（1）5’端标记法（T4噬菌体多苷酸激酶）用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5’末端的磷酸基团，使其成为5’-OH，然后在（γ-32P）ATP存在下，经T4噬菌体多苷酸激酶催化，将γ位上的32P转移到DNA或RNA分子的5’-OH末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5’端均带32P标记。T4噬菌体多苷酸激酶催化（2）3’端标记法（大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段）大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段有5’→3’DNA聚合酶和微弱的3’→5’外切酶活性，但无5’→3’外切酶活性。对残缺3’末端可进行标记。四、杂交与杂交后检测（一）核酸分子与固相介质的结合1、支持介质的类型和性质硝酸纤维薄膜：本底低，易检测杂交信号对小于500碱基的核酸结合力低，脆性大易破裂。尼龙膜和带电荷的尼龙膜：耐用，结合力强，但其本底高。（二）核酸分子的转移1、噬菌体/克隆的转移2、从凝胶上转移DNA（1）虹吸转移（2）电转移（3）真空转移虹吸转移电转移真空转移（三）核酸的固定1、烘烤80℃2小时2、紫外光固定3、碱固定（四）杂交1、预杂交（1）目的：减少非特异性杂交（2）成分：去污剂：1%SDS（可促进溶液对薄膜的覆盖，可抑制RNase酶活性）封闭剂：Denhard氏溶液2、杂交影响杂交的因素1）影响杂交速率和杂交分子稳定性的因素◇核酸分子浓度与杂交速率◇碱基组成：探针的Tm高，杂交速率快◇盐浓度：离子强度与杂交速率成正比；与杂交稳定性也成正比。◇温度：与杂交速率成反比。影响杂交的因素2）酶联探针3）杂交反应体积4）杂交时间3、洗脱除去溶液未反应的探针与滤膜疏松结合的探针非特异性结合的探针（五）杂交信号的检测放射自显影非放射性杂化分子的检测五、分子杂交技术液相杂交、固相杂交、原位杂交、基因芯片（一）液相分子杂交将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度、温度、时间等）进行杂交，然后利用羟磷灰石柱选择性结合单链或双链核酸的性质分离杂交体和未参加反应游离的核酸探针，用计数器或核酸分子的减色性分析杂交结果（二）固相分子杂交将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，而标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固相杂交。其可通过漂洗能将未杂交的游离探针除去，留在膜上的杂交分子容易被检测，能防止靶DNA的自我复性，故被广泛应用。1、菌落原位杂交用于重组细菌克隆筛选的固相杂交。主要步骤：菌落平板培养滤膜灭菌后放到细菌平板上菌落粘到滤膜上滤膜放到杂交液中探针杂交检测2、Southern印迹杂交膜上检测DNA的杂交技术，1975年由EdwinSouthern建立。利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。3、Northern印迹杂交应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小，其方法类似于Southern印迹杂交。4、斑点杂交（dot-blotting）（三）原位杂交1、定义：将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称为原位杂交（hybridizationinsitu)。2.核酸原位杂交技术的特点：特异性、敏感性高。可检测的靶序列在组织细胞内定位。能够将组织学表现与基因功能的变化相结合。可完好的保存组织、细胞的形态结构。不需要从组织细胞中提取核酸,避免了抽提中核酸量的损失对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性，可在1%细胞中检出目的核酸序列。可用于研究个别细胞中的核酸,而不受组织中其它细胞的影响。不需破裂细胞,经适当处理后探针可进入细胞,与细胞内核酸杂交。3、操作步骤：载片的清洁与处理组织与细胞的固定探针湿盒4、杂交条件（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间（1）、杂交液①钠盐（杂交效率↑非特异反应↓）②甲酰胺（使杂交所需温度降低）③硫酸葡聚糖（提高探针浓度）④牛血清白蛋白和载体DNA等（阻断探针与组织非特异结合，↓背景）杂交条件（2）、探针浓度探针浓度影响杂交反应的速度放射性标记探针0.5μg/ml非放射性为2μg/ml最适宜的探针浓度要经实验摸索得到确定（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间杂交条件（3）、温度杂交时温度一般低于相应杂交体的Tm值25℃Tm值：是核酸的融解温度，是一半双链分子解链时的温度当杂交液含50%甲酰胺、盐浓度0.75mol/L左右时杂交温度：对DNA探针是42℃对RNA探针是50-55℃对寡核苷酸探针是37℃1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间杂交条件（4）、PHpH在5-9范围内，杂交体形成不受影响常用缓冲液pH为6.5-7.5（5）、时间一般探针浓度下，杂交反应在4-6小时内完成孵育6小时后-杂交信号不再增强反应超过24小时后-已形成的杂交体可能发生解链，杂交信号反而减弱（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间HPVHPVFISHFISH（四）基因芯片技术是集成化的核酸分子杂交技术。蛋白杂交一、蛋白质的免疫印迹（Western)场所：硝酸纤维素膜待检分子：蛋白探针：抗体杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转印到硝酸纤维素膜上，用特定的抗体与蛋白杂交，检测特定的蛋白。WesternBlotWesternBlot基本原理基本原理WesternBlotWesternBlot优点优点高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原-抗体反应1-5ng中等大小的靶蛋白WesternBlotWesternBlot应用应用目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析WesternBlotWesternBlot流程流程蛋白样品的制备•SDS-PAGE•转膜•封闭•一抗杂交•二抗杂交•底物显色通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。。有机溶剂提取法有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的提取蛋白样品的提取蛋白样品的定量蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：目前常用比色法测定样品蛋白的含量：BradfordBradford法（考马斯亮法（考马斯亮蓝法）、蓝法）、LowryLowry法（法（FolinFolin--酚试剂法）、酚试剂法）、BCABCA法等。但各有优缺法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。作说明操作，测定样品浓度。蛋白样品的变性蛋白样品的变性2×SDS‐PAGE上样缓冲液：DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，‐20℃冻存。按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20‐25μl，总蛋白量20～50μg。1M Tris‐HCl(pH6.8)10 ml1M  DTT20 mlS