第五章重组DNA技术

第五章重组DNA技术以LNX1基因的表达载体构建进行说明第一节重组DNA技术的主要工具一限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能Taq酶用于PCRDNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基第二节载体载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)含有能被宿主细胞基因表达系统识别的表达元件、从而可以在宿主细胞内表达目的基因合成目的蛋白的载体。载体的选择标准•复制的起始点，能自主复制；•选择标记，具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；•有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；•分子量小，以容纳较大的外源DNA。•表达载体还要有表达元件。质粒(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。第二节重组DNA技术的基本原理基本原理获取目的基因，选择载体DNA导入受体菌外源基因与载体的连接切割目的基因和载体重组体的筛选克隆基因的表达以质粒为载体的DNA克隆过程一目的基因的获取1.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)2.cDNA文库(cDNAlibrary)3.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)4.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。三目的基因与载体的连接二克隆载体的选择和构建1.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连2.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接单酶切末端连接双酶切末端连接BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGT4DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体DNA用BamHⅠ切割同一限制酶切位点连接GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连目的基因自连目录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEcoRⅠ切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABglⅡ切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAG+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶T4DNA连接酶15ºC重组体目录5´3´3´5´5´3´T(T)nTT(T)nT3´5´5´3´3´5´5´3´A(A)nAA(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTP4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)导入方式转化(transformation)：重组DNA导入宿主细胞的过程。四重组DNA导入宿主细胞五筛选和鉴定重组体1.平板筛选2.酶切分析3.PCR分析4.核酸分子杂交分析(插入失活法)抗药性标记选择鸡的β肌球蛋白的克隆和检出重组DNA技术操作过程可形象归纳为分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物第三节LNX1基因的表达载体构建1、查找基因序列，根据基因序列设计PCR引物1tttcctggtctggagcgaccaatgccgtcctccttcctccaggcacctgttcaccgaagt61tgaggctggtcacaactccggcggcccaaggagctgctcggttcacccacaaggaatgag121agctgcctgcctgctgctgcttggagagccccagacagtcgcttgaagaggtgtgtggat181gtctcctagatcttgacttgctcctgaggaaatattgtgtgactgagtttcctgttatac241tgctctccaatccatcatgaaccagccagagtctgccaacgatcctgaacccctgtgtgc301agtgtgtggccaagcccactccttggaggaaaaccacttctacagctatccagaggaagt361ggatgatgacctcatctgccacatctgcctgcaggctttgctggaccccctggacactcc421gtgtggacacacctactgcaccctctgcctcaccaacttcctggtggagaaggacttctg481tcccatggaccgcaagcctctggttctgcagcactgcaagaagtccagcatcctggtcaa541caaactcctcaacaagctactggtgacctgcccattcagggagcactgcacccaggtgtt601gcagcgctgtgacctcgagcatcactttcaaaccagctgtaaaggtgcctcccactacgg661cctgaccaaagataggaagaggcgctcacaagatggctgtccagacggctgtgcgagcct721cacagccacggctccctccccagaggtttctgcagctgccaccatctccttaatgacaga781cgagcctggcctagacaaccctgcctacgtgtcctcggcagaggacgggcagccagcaat841cagcccagtggactctggccggagcaaccgaactagggcacggccctttgagagatccac901tattagaagcagatcatttaaaaaaataaatcgagctttgagtgttcttcgaaggacaaa961gagcgggagtgcagttgccaaccatgccgaccagggcagggaaaattctgaaaacaccac1021tgcccctgaagtctttccaaggttgtaccacctgattccagatggtgaaa………….SalⅠ-LNX-FP-2445'GCGTCGACTCTCCAATCCATCATGAACCAG3'SalⅠ-LNX-FP-13095'ATGTCGACGTGGCTGACTGTGATGCGTG3'KpnⅠ-LNX-RP-24775'ATCCATGGGATTTTTCTGTTTTCCTCTGACCC3'SalⅠ-短LNX-FP-2835'ACGTCGACAAGGCAGCACACTGCTCGGAG3'SalⅠ-短LNX-FP-2745'ACGTCGACGCCAGGGAGAAGGCAGCACAC3'KpnⅠ-短LNX-RP-22405'ATCCATGGTGTGATTTTTCTGTTTTCCTCTGAC3'SalⅠ-LNX-FP-2175'ACGTCGACGTGTGACTGAGTTTCCTGTTATACTG3'SalⅠ-LNX-FP-2805'ACGTCGACCGATCCTGAACCCCTGTGTGC3'KpnⅠ-LNX-RP-13275'ATCCATGGTTAACGCATCACAGTCAGCCACAGC3'2、利用设计的PCR引物和脑库cDNA模板进行PCR3、切胶回收PCR产物，与T载体进行连接T载体结构图连接体系如下：载体0.5ulPCR回收产物9.5ulSolutionⅠ10ul混匀后16℃水浴24小时连接。4、重组T载体进行转化培养以得到大量重组质粒TOP10感受态的制备：常规转化方法：即从-80℃冰箱取出感受态TOP10后，冰中解冻半小时，然后加入质粒，混匀后冰中半小时，在42℃热激90秒，冰中放5分钟，加入800ul2YT液体培养基培养20-30分钟，5000rpm离心3分钟，吸出850ul上清后混匀沉淀再涂Amp平板。37℃培养箱中培养12小时。细菌培养和重组质粒的提取：1、挑取Amp平板中的单个菌落，在4ml2YT液体培养基中培养。2YT的配制：称取酵母粉3g，蛋白胨4.8g，NaCl1.5g，溶解后定溶至300ml，4ml每管分装后，120℃灭菌35分钟即成。2、质粒提取：一般按试剂盒说明提取，包括离心沉淀细菌→含RNA酶的缓冲液重新悬浮细菌→加碱性裂解液裂解细菌→加中和液中和→离心沉淀蛋白质等杂质→上清用柱子结合质粒→洗涤液洗涤→蒸馏水洗脱质粒5、对重组质粒进行PCR鉴定与酶切鉴定以及测序6、将对的重组质粒与表达载体进行双酶切7、回收酶切载体与克隆片段，并进行连接，再通过测序验证8、转化进入细胞检查表达情况