第八章基因重组和杂交育种

第三节基因重组和杂交育种凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（generecombination）或遗传重组（geneticrecombination），简称重组。重组杂交（hybridization）遗传物质分子水平上的杂交细胞水平细胞水平的杂交包含分子水平上的重组。基因重组是杂交育种的理论基础。在方向性还是自觉性方面，比诱变育种前进了一大步。且可消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。一、原核生物的基因重组原核生物的基因重组形式很多，机制较原始。特点：①片段性，仅一小段DNA序列参与重组；②单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组向受体基因组）作单方向转移；③转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。受体菌（recipientcell，receptor）直接吸收供体菌（donorcell）的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。通过转化方式而形成的杂种后代，称转化子（transformant）。（一）转化（transformation）1.定义自然遗传转化（naturalgenetictransformation）人工转化（artificialtransformation）原核生物Streptococcuspneumoniae（肺炎链球菌）、Haemophilus（嗜血杆菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）、Neisseria（奈瑟氏球菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、Xanthomonas（黄单胞菌属）等。2.转化微生物的种类真核微生物Saccharomycescerevisiae（酿酒酵母）、Neu-rosporacrassa（粗糙脉孢菌）、Aspergillusniger（黑曲霉）等。3.感受态（competence）感受态是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。研究发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。感受态细胞（competentcell）具有摄取外源DNA能力的细胞。自然感受态是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）感受态受遗传控制，但也存在个体差异。感受态出现的时间不同；感受态细胞所占比例和维持时间不同；外界环境因子如腺苷酸（cAMP）及Ca2＋等对感受态也有重要影响。调节感受态的一类特异蛋白称感受态因子。膜相关DNA结合蛋白（membrane-associatedDNAbindingprotein）细胞壁自溶素（autolysin）几个核酸酶4.转化因子（transformingprinciple）转化因子的本质是离体的DNA片段。一般只有15kb左右。在不同的微生物中，转化因子的形式不同。良好的转化因子有dsDNA（最宜于细胞表面结合）、ssDNA和质粒DNA，通常不能与核染色体组发生重组。转化的频率通常为0.1％～1.0％，最高为20％。能发生转化的最低DNA浓度极低，为化学方法无法测出的1×10－5mg／mL（即1×10－11g／mL）。5.转化过程（1）自然遗传转化（简称自然转化）1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）的转化现象，转化过程研究得较深入的就是这种G＋细菌。目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力进行自然转化，需要二方面必要的条件：①建立了感受态的受体细胞②外源游离DNA分子枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）strR，存在抗链霉素的基因标记strS，有链霉素敏感型基因标记自然转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）供体菌和受体菌之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；b）不需要活的DNA给体细胞；提高质粒的自然转化效率的二种方法：1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有活性的质粒的几率大大提高；2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌——重组获救。（2）人工转化用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。质粒的转化效率高；指用提纯的病毒核酸（DNA或RNA）去感染其宿主细胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。6.转染（transfection）噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。特点：转染转化把重组噬菌体或重组病毒DNA引入受体细胞以质粒为载体的重组DNA分子引入受体细胞（二）转导（transduction）通过缺陷噬菌体（defectivephage）的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，就称转导子（transductant）。由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体。细菌转导的二种类型：普遍性转导局限性转导流产普遍转导完全普遍转导1.普遍转导（generalizedtransduction）通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称为普遍转导。一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。（1）完全普遍转导简称普遍转导或完全转导（completetransduction）。经转导嗜菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，外源DNA在其内进行交换、整合和复制，使其成为一个遗传性状稳定的重组体，称作普遍转导子，这种现象就称普遍转导。Salmonellatyphimurium（鼠伤寒沙门氏菌）的野生菌株Salmonellatyphimurium（鼠伤寒沙门氏菌）的营养缺陷型突变株P22嗜菌体供体菌受体菌转导模型供体菌受体菌转导媒介—嗜菌体误包转导颗粒普遍转导子双交换同源配对10-6～10-8S.typhimurium的P22噬菌体、E.coli的P1噬菌体、Bacillussubtilis的PBS1和SP10等噬菌体都能进行完全普遍转导。供体菌转导媒介——嗜菌体受体菌（2）流产普遍转导简称流产转导（abortivetransduction）。经转导嗜菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。受体菌外源DNA细胞分裂外源基因经转录、转译而形成的少量酶获得外源DNA获得少量酶不断稀释特点：在选择培养基平板上形成微小菌落DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。普遍性转导的三种后果：进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子。流产转导（abortivetransduction）转导DNA不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培养基平板上形成微小菌落外源DNA被降解，转导失败。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。2.局限转导（specializedtransduction，restrictedtransduction）指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。最初于1954年在E.coliK12中发现。特点：①只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因，一般为噬菌体整合位点两侧的基因；②该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带；③缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主染色体过程中，发生低频率（～10-5）“误切”（不正常切离，abnormalexcesion）或由于双重溶源菌的裂解而形成；④局限转导噬菌体的产生要通过UV等因素对溶源菌的诱导并引起裂解后才产生。局限转导低频转导高频转导根据转导子出现频率的高低分类温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的λDNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。E.coli的λ嗜菌体和φ80嗜菌体具有局限转导的能力。3.溶源转变（lysogenicconversion）正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主核基因组上，而使宿主获得了除免异性外的新遗传性状的现象，称溶源转变。一个与转导相似又不同的现象溶源转变与转导的不同？a）这是一种不携带任何外源基因的正常时菌体；b）是嗜菌体的基因内而不是供体菌的基因提供了宿主的信性状；c）新性状是宿主细胞溶源化时的表型，而不是经遗传重组形成的稳定转导子；d）获得的性状可随嗜菌体的消失而同时消失；（三）接合（conjugation，mating）供体菌（“雄性”）通过性菌毛与受体菌（“雌性”）直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就是接合子（conjugant）。1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！大肠杆菌的接合机制接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛（sexpili）及控制接合过程进行的20多个基因。含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛F因子为附加体质粒可脱离染色体在细胞内独立存在，可插入（整合）到染色体上F因子的四种细胞形式a）F-菌株，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。细胞表面同样有性菌毛。（四）原生质体融合（protoplastfusion）通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定的重组子的过程，称为原生质体融合。由此法获得的重组子，成为融合子（fusant）。选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本脱壁酶细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处理，真菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶等离心聚集在高渗溶液中稀释加入促融合剂或电脉冲各种选择性培养基原生质体融合的主要步骤是：原生质体融合的重组频率已大于10-1（而诱变育种一般仅为10-6）；同种的不同菌株间或种间进行融合，属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合，以期达到生产性状更为优良的新物种。二、真核微生物的基因重组有性杂交准性杂交