第四篇-动物细胞微囊化培养

一、微囊法（microencapsulation）:用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜；囊内是种微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。第四章动物细胞的微囊化培养图4－1微胶囊示意图微胶囊膜生物大分子代谢产物细胞营养物质二、研究发展历程1、首次报道生物活性物质的微囊化研究（1957）：将酶、蛋白质和激素等生物活性物质包封在选择性透过膜中，形成球状微胶囊,称之为“生物微胶囊”。通过微胶囊膜的选择透过作用,使囊外大于某一分子量的物质不能扩散进入,而生物环境中的营养成分和囊内生物活性物质或细胞分泌的小分子产物可以自由出入微胶囊,从而达到免疫隔离目的。2、“人工细胞”——“人工胰腺”80年代初,Lim等人将微囊化技术与组织细胞移植相结合,制备了海藻酸钠/聚赖氨酸(APA)微胶囊,包埋猪胰岛细胞形成“人工细胞”,并移植入糖尿病大鼠体内,结果成功地调节了血糖水平,代行了大鼠胰腺功能,因而被称为“人工胰腺”。该成果较好地解决了组织细胞移植过程的免疫排斥问题,避免或减少了昂贵的免疫抑制剂的使用,为组织细胞移植治疗神经/内分泌系统疾病提供了新思路。3、90年代以来,医学界开始尝试以微胶囊作为基因重组细胞的免疫隔离和运载工具,利用重组细胞的代谢产物调节机体生理功能,治疗相关疾病。微囊化人胰岛培养15d微囊化小牛肾上腺嗜铬细胞培养0d微囊化肝癌细胞培养40d4、目前，微胶囊的应用研究涉及药物控制释放、动植物细胞培养、细胞和酶的固定化以及生化物质分离等领域,已经成为材料、化学、化工、生物和医学等多学科领域工作者的研究热点。SEM下微胶囊的显微形貌×200LSCM下微胶囊表面形貌的照片不同放大倍数的海藻酸钙微胶囊的SEM照片不同放大倍数的壳聚糖/海藻酸钠微胶囊的SEM照片三、性质：曾是酶固定化技术中的一种（半透膜将酶包裹在球状的微囊里，酶及大分子不能从微囊里透出，而小分子物质可自由通过膜）。动物细胞微囊化后，与游离细胞相比，降低了培养时对细胞的剪切力，同时也能提供很高的细胞密度，使得产物浓度增加，纯度提高。动物细胞微囊化培养的成功为干扰素、乙肝表面抗原(HBsAg)、单克隆抗体(MAb)等)的产生提供了广泛应用前景。表4－1微胶囊制备材料来源类型材料天然脂质卵磷脂、神经鞘髓磷脂等多糖海藻酸盐、壳聚糖、琼脂、淀粉等蛋白质明胶、白蛋白、纤维蛋白半合成纤维素类衍生物羧甲基纤维素钠、已基纤维素、醋酸纤维素及其酯等合成可降解型乳酸/乙醇酸共聚物、聚正酯、聚内酯、聚酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨基酸非降解型聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚苯乙烯、乙烯醋酸乙酯共聚物、聚氯乙烯等制备方法化学法界面聚合法、乳化法、辐射化学法物理化学法相分离法、溶剂蒸发法、界面沉积法、喷雾干燥法物理法静电沉积法、气相沉积法、流化床喷雾包衣法图2制备方法使用率比较1－－乳化法，2－－静电法，3－－聚合法，4－－沉积法，5－－相分离法，6－－喷雾干燥法，7－－溶剂蒸发法四、微囊化培养技术要点:在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再将微囊放入培养系统内进行培养。生长介质为1.4%海藻酸钠溶液,半透膜由多聚赖氨酸形成。培养系统可采用搅拌式或气升式反应器系统，微囊直径控制在200-400μm为宜。微胶囊膜生物大分子代谢产物细胞营养物质五、动物细胞微囊化的制备•主要是应用海藻酸—聚氨基酸的方法简单过程：动物细胞与海藻酸溶液混合搅拌，经过微囊发生器将微球滴入氯化钙(cacl2)溶液中，形成凝胶，然后再用聚氨基酸处理，使微球表面成膜，最后用柠檬酸处理去除微球内的钙离子，以便球内的海藻酸成液态，动物细胞得以悬浮在其中。动物细胞的微囊化中海藻酸和聚氨基酸是关键材料。针头CaCl2液微珠磁力搅拌器（微囊发生器）海藻酸/细胞悬浮液聚氨基酸柠檬酸聚赖氨酸/海藻酸微囊化步骤：1.悬浮细胞胶状液；2.成滴器；3.胶化小珠；4.包被溶液；5.显微镜下微囊；6.多孔微囊膜；7.完成操作后的微囊。制备注意事项：●温和、快速、不损伤细胞，尽量在液体和生理条件下操作；●所用试剂和膜材料对细胞无毒害；●膜的孔径可控制，必须使营养物和代谢物自由通过；●膜应有足够机械强度抵抗培养中搅拌。①可防止细胞在培养过程中受到物理损伤;②活性蛋白不能从囊中自由出入半透膜,从而提高细胞密度和产物含量,并方便分离纯化处理。①微囊制作复杂,成功率不高;②微囊内死亡的细胞会污染正常产物;③收集产物必须破壁,不能实现生产连续化。六、微囊化培养的优、缺点:七、微胶囊在生物医学领域应用研究1、在临床医学中的应用研究•采用一定材料、方法制成的微胶囊本身并不具备治疗疾病的作用,但能保证囊内包埋的细胞存活且正常代谢、应答式分泌有效物质,如胰岛素、多巴胺和甲状腺激素等,从而治疗疾病。•微胶囊膜的选择透过作用可以保证细胞分泌的有效物质扩散进入生物体内发挥生理功能,而将免疫球蛋白等抗体阻隔在囊外,避免了异种移植中最棘手的免疫排斥问题。2、在生化药物控制释放中的应用研究微胶囊膜能最大程度地保持囊内生化物质（生长激素、胰岛素、肝素、干扰素、促甲状腺素、人类免疫缺损疫苗）活性,不同程度地提高了药物的生物利用度。通过调节制备条件可以控制微胶囊膜的厚度和孔尺寸，从而实现囊内生化药物的控释或缓释。临床应用的主要技术问题：如何更好地保持囊内蛋白质的生物活性；作为控制释放载体的微胶囊材料的生物相容性；开发条件温和且易于规模化生产的微胶囊制备技术。作业：•试述动物细胞培养的常用方法。•最常用的微囊化培养的方法是什么?其原理及操作过程?•为什么要进行微载体培养?动物细胞微载体培养的主要优点?•优良的微载体应该具备什么特性?试述主要的微载体种类?