蓝白斑筛选lacZ

阳性克隆的快速检测一、实验目的学习蓝白斑筛选试验中阳性克隆的快速检测方法掌握蓝白斑筛选的原理和方法二、蓝白斑筛选的原理重组质粒转化细菌后，蓝白斑筛选往往是基于抗生素筛选基础上的第二次筛选。一般培养转化细菌的培养基中都要加入一定浓度的适宜抗生素，只有含有质粒载体的细菌才可以生长形成菌落，即抗生素完成对细菌是否含有质粒载体进行了初步筛选。质粒载体上存在的LacZ基因片段当被外源DNA片段插入时，会产生白色的克隆，不含插入片段的质粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。这就是蓝白斑筛选，即a-互补显色反应lacZβ-半乳糖苷酶分解乳糖iPO调控蛋白P大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统a-互补显色反应（蓝白斑筛选）lacZ-β-半乳糖苷酶-分解乳糖iPO调控蛋白Pα-肽段分解X-gal产物呈现蓝色诱导剂IPTGβ-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15三、实验材料、器具及药品实验器具1.5mlEp管，离心管架，微量取液器，台式高速离心机，恒温振荡摇床，电泳仪，紫外透射检测仪。实验材料LB固体培养基上生长的蓝白菌斑实验药品1.溶液Ⅱ0.4mol/LNaOH2%SDS临用前1:1混合贮存液即为II液.2.分离液酚/氯仿/异戊醇＝25:24:13.1%琼脂糖凝胶四、实验步骤分别挑取多个白色菌斑和一个蓝色对照菌斑到1.5ml含有80μg/mlKan抗生素的LB液体培养基37℃摇培过夜（10~12h）6000rpm,3min弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。短暂离心，收集剩余上清，弹匀至没有明显菌块加50μlII液，充分混匀加100μl酚-氯仿-异戊醇，涡旋振荡，使溶液呈现乳白色12000rpm,10min取10μl上清液，电泳检测。