拟南芥的种植

一、拟南芥播种种子装入dorf管内，20μl种子加1ml75%乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml50%次氯酸钠：50%无菌水：0.05%吐温（or5%漂白粉），震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠或漂白粉，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；将种子用接种环均匀铺于MS培养基上，用封口膜封口，放入4℃冰箱内冷处理2-3天（春化）。MS培养基的用量：直径为9cm的培养皿用25ml，直径为6cm的培养皿用12.5ml。二、MS固体培养基制备1．培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20(50mL)或1/200(5mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。大量元素(母液Ⅰ，20×)mg／LNH4NO333000KNO338000CaCl2·2H2O8800MgSO4·7H2O7400KH2PO43400微量元素(母液Ⅱ，200×)mg／LKI166H3BO31240MnSO4·4H2O4460ZnSO4·7H2O1720Na2MoO4·2H2O50CuSO4·5H2O5CoCl2·6H2O5铁盐(母液Ⅲ，200×)mg／LFeSO4·7H2O5560Na2-EDTA·2H2O7460有机成分(母液Ⅳ，200×)mg／LⅣA肌醇20000ⅣB烟酸100盐酸吡哆醇(维生素B6)100盐酸硫胺素(维生素B1)100甘氨酸400上述几种母液都要单独配成1L的贮备液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L。母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1L，保存在棕色玻璃瓶中。2．配制培养液用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5mL。3．溶化琼脂4．调pH用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8，因高温灭菌时pH会下降，所以灭菌前通常pH配成6.2左右)。5.培养基的分装6．高压灭菌三、拟南芥的种植1．人工土配制18份蛭石，6份黑土和1份珍珠岩混合均匀，分装于塑料灭菌袋内，扎好口，于98kPa、121.3℃下，灭菌40min。冷却后备用。有时也用两种土，即上层用不含黑土的人工土，下层用上面所讲的土。我估计原因可能有二：一是黑土容易生霉；二是黑土较难完全粉碎，较大的块状土不便于移栽。2．PNS营养液：每升含5ml1MKNO3，2ml1MCa(NO3)2˙4H2O，2ml1MMgSO4˙7H2O，2.5ml20mMFe.EDTA，2.5ml1M磷酸缓冲液（pH5.5），1ml微量元素。注意：营养液用煮沸冷却后的凉开水配置。PNS营养液母液配方：①1MKNO3101.1g②1MCa(NO3)2˙4H2O236.15g③1MMgSO4˙7H2O，246.48g④20mMFe.EDTA：FeSO45.57gEDTA7.45g注意先各自配成溶液，再混合。⑤1M磷酸缓冲液（pH5.5）：磷酸二氢钾130.4g磷酸氢二钾9.12g⑥微量元素硼酸0.434g硫酸锰（MnSO4H2O）1.7626gCuSO4˙H2O0.0798gZnSO4˙7H2O0.172gNaMoO4˙2H2O0.0432gNaCl0.585gCoCl˙6H2O0.00129g以上母液均配至1L种子春化A．取适量种子置于标记好的1.5ml离心管中，加入1ml70％乙醇轻微振荡1minB．去乙醇，加入1ml体积分数为10％的NaClO(次氯酸钠),消毒5~10min；C．吸去NaClO,用无菌水冲洗种子5次后,加入600μl无菌水；D．用1ml移液枪将水连同种子吸起，均匀铺于MS平板，每皿60~100粒种子；E．吸去并风干培养基表面多余的水分。F．加盖，封口，4℃冰箱放置2~3d，春化使种子萌发同步化。土壤培养从春化算起，平板上培养7~14d，当幼苗具4片真叶时转入土壤(1株/盘)进行土培。加盖保鲜膜1d，及时浇水。培养条件温度：20℃~22℃；湿度：70％左右；光照强度：100~120µmolm-2sec-1；在长日照条件下（16h光照，8h黑暗）培养。不同光质处理时，各种光质相应光强分别为，蓝光（BL）：20μmol.m-2.s-1；红光（Rc）：20μmol.m-2.s-1；远红外光（FRc）：1.8μmol.m-2.s-1，其余条件同前。