质谱分析技术简介

一、质谱分析技术简介IntroductionofMassSpectrometry主要内容1、概述2、质谱仪的基本结构①进样系统②离子化及离子源③质量分析器④离子检测根据用途根据质量分析器的工作原理质谱静态质谱动态质谱采用稳定磁场，按空间位置区分不同m/z的离子。采用变化的电磁场，按时空来区分不同m/z的离子。1、概述质谱分析法——将样品分子经过离子化后，利用其不同质荷比(m/z)的离子在静电场和磁场中受到的作用力不同，形成不同的运动方向，导致彼此的分离，并通过收集和检测这些离子得到质谱图，实现分析目的的一种分析方法。不同m/z离子在电/磁场中分离不同波长的光经棱镜分开离子源光源棱镜质谱分析器检测器质谱仪的工作原理：样品挥发进入离子化室，并会聚成离子束。狭缝处正、负离子分开、并进入分离管。高真空度的分离管中，不同质荷比的离子实现时空分离。检测器中检测和记录。计算机采集、处理数据，并检索分析结果。2、质谱仪的基本结构质谱仪主要由进样系统、离子源、质量分析器和检测器等4个部件组成。MassSpectrumm/zIonSource离子源MassAnalyzer质量分析器IonDetector离子检测器数据处理系统真空系统10-2-10-6PaInletSystem进样系统最常见的试样引入方式有：•直接插入(directinsertion):样品置于探针或样品板(如MALDI)直接插入离子源，热或激光解吸使之挥发和离子化。•直接喷入(directinfusion)：采用毛细管或毛细管柱将气体或液体样品喷入质谱仪中进行分析检测（如EI,ESI)，可以通过注射泵连续泵入或GC/MS、LC/MS接口）（1）进样系统(MALDI)(EI,ESI)使中性分子离子化的方法包括：•质子化(protonation):M+H+→MH+蛋白质、多肽等多种生物分子中含碱性基团如氨基，易结合质子形成稳定的正离子。每加一个H+，带正一价离子。如多肽H2N-RGASRR-OH+H+→+H3N-RGASRR-OH(MH+)（2）离子化方法和离子源MH+702.4MH22+351.7RelativeInt.(%)50750m/z•脱质子化(deprotonation):M→[M-H]-酚、羧酸、磺酸等酸性物质，易失去质子形成稳定的负离子。如唾液酸(Sialicacid):是9-碳单糖的衍生物。[M-H]-308.1RelativeInt.(%)10330m/z•阳离子加合物(Cationization):M+Na+→MNa+(或K+,NH4+)•排斥电子(electronejection):M-e-→M+低分子量的非极性化合物，如蒽C14H10。常见于EI源。•捕捉电子(electroncapture):M+e-→M-.具有强电子亲合力的化合物，如卤化物等。•荷电分子直接转化为气相(transferofachargedmoleculetothegasphase):离子化方法优点缺点质子化（正离子）很多化合物可以接受质子；适用于多种离子源，如ESI,APCI,FAB,MALDI。某些化合物如糖类等的质子结合物不够稳定或不易接受质子脱质子化（负离子）适用于酸性物质；适用于多种离子源。受化合物物种的限制阳离子加合物（正离子）很多化合物形象K+、Na+和NH4+的加合物；适用于多种离子源。不适用于串联质谱；不产生片段离子排斥电子（正离子）常见于电子轰击源(EI)产生过多的碎片离子；难以确定最高质量的离子是不是分子离子。捕捉电子（负离子）同上同上荷电分子直接转化为气相（正或负离子）适用于多种离子源。只适用带电的化合物各种离子化方法的优缺点离子源作用：将被分析的样品分子电离成带电的离子，并使这些离子在会聚成有一定几何形状和能量的离子束。种类：硬源：如EI。离子化能量高，伴有化学键的断裂，谱图复杂，可得到分子官能团的信息，软源：如CI,FI,FD,FAB,APCI,ESI,TSP,LD,MALDI……离子化能量低，产生的碎片少，谱图简单，可得到分子离子峰，即得到分子量信息，气相源：如EI,CI,FI解吸源：如FD,FAB,APCI,ESI,TSP,LD,MALDI…常见离子源离子源简称离子化试剂最初应用年份电子轰击离子化(electronbombionization)EI高能电子1920化学电离(chemicalionization)CI试剂离子1965场电离(fieldionization)FI高电势场1970场解吸(fielddesorption)FD高电势场1969快原子轰击(fastatombombandment)FAB快原子或离子束1981电喷雾离子化(electrosprayionization)ESI荷电微粒能量1984基质辅助激光解吸(matrix-assistedlaserdesorptionionization)MALDI激光束1988………………电子轰击电离源（EI）采用高速(高能)电子束冲击样品，从而产生电子和分子离子M+：M+e→M++2e高能电子束产生的分子离子M+将进一步裂解，释放出部分能量，并产生质量较小的碎片离子和中性自由基：M+M1++N1·M2++N2·加速加速聚焦eM特点：使用最广泛，谱库最完整；电离效率高；结构简单，操作方便；但分子离子峰强度较弱或不出现(因电离能量最高)。化学电离源（CI）离子化过程：甲烷首先在电子轰击下被电离：CH4+→CH4+＋CH3+＋CH2+＋CH+＋C+＋H+甲烷离子与分子进行反应，生成加合离子：CH4+＋CH4→CH5+＋CH3CH3+＋CH4→C2H5+＋H2离子化机理：样品分子在承受电子轰击前，被一种反应气(通常是CH4)稀释，稀释比例约为104:1，因此样品分子与电子的碰撞几率极小，所生成的样品分子离子主要经过离子-分子反应组成。加合离子与样品分子反应：CH5+＋M→MH+＋CH4C2H5+＋M→MH+＋C2H4CH5+＋M→(M-H)-＋CH4+H2C2H5+＋M→(M-H)-＋C2H6复合反应：CH5+＋M→(M+CH5)+(M+17)+C2H5+＋M→(M+C2H5)+＋C2H4(M+29)+(M+1)+(M-1)-一系列准分子离子EICI准分子离子(M+1)+分子离子M+CI和EI所获得到质谱图比较CI的特点：电离能小，质谱峰数少，图谱简单；准分子离子(M+1)+峰大，可提供分子量这一种要信息；不适用于难挥发，热不稳定或极性较大的有机物分析。场致电离源（FI）离子化机理：应用强电场诱导样品电离：(电压：7～10kV，d1mm)离子化过程：样品蒸汽邻近或接触带高的正电位的阳极尖端时,由于高曲率半径的尖端处产生很强的电位梯度,使样品分子电离。FI与EI所产生的质谱图对比FI特点：电离温和，碎片少，主要产生分子离子M+和(M+1)+峰。EIFI场解吸电离源（FD）过程：样品溶液涂于发射器表面→强电场→分子电离→奔向阴极→引入磁场特点：特别适于非挥发性且分子量高达10,0000的分子;样品只产生分子离子峰和准分子离子峰，谱图最为简单。EIFIFD快原子轰击电离源（FAB）过程：稀有气体（如氙或氩电离）通过电场加速获得高动能→快原子→快原子撞击涂在金属板上的样品→样品分子电离→二次离子→电场作用下，离子被加速后→通过狭缝进入质量分析器。特点：分子离子和准分子离子峰强；碎片离子峰也很丰富；适合热不稳定、难挥发样品分析；样品涂在金属板上的溶剂也被电离，谱图复杂化。结构：喷嘴(金属或镀金属的毛细管)，雾化气，干燥气原理：喷雾→蒸发→电压电喷雾电离(ESI)离子在电压差和压力差的驱使下向下游移动ESI过程：形成带电的液滴溶剂蒸发和液滴破碎形成气态离子•带电离子形成Taylor锥⇒形成液滴⇒液滴破碎ESI的特点：电喷雾源属软电离技术，只产生分子离子，不产生碎片离子。产生的离子常常带有多电荷，尤其是生物大分子。适用于强极性，大分子量的样品分析，如肽，蛋白质，糖等。主要用于液相色谱-质谱联用仪。ESI使蛋白质产生多个带多电荷离子数个带多电荷离子经数学转换，得到分子离子NanoESIESI:~100µL/minNanoESI:~100nL/min•雾化效率更高•试剂/试样消耗量更少。HeQHetal.FabricationofaPSmicrofluidicchipcoupledtoESIMSforproteinanalysis,J.Chromatogr.B,2015,990:96-103一体化PS微流控芯片（集成电喷雾金薄膜电极、酶）PS通道选择性修饰、固定胰蛋白酶细胞色素C在线酶解-ESI-MS分析离子化原理：用小分子有机物作为基质,样品与基质混合1:(102-105)干燥、送入离子源内真空下，激光辐照基质吸收激光能量,并转变成基质离子样品与基质离子碰撞过程中,并离子化。基质辅助激光解吸电离（Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization,MALDI）特点：用于生物大分子，主要产生[M+H]+和[M-H]-加和离子。•MALDI中的基质通常是有机小分子，能有效地吸收激光照射的能量。基质应具有的功能：吸收能量；使被分析物（如生物大分子）彼此分离。生物大分子与极大数量的基质混合，从而使原本比较强的分子间作用力得到消弱；帮助分析物离子化。常见的MALDI基质MALDI法的优点：属于软电离，通常形成单电荷离子，可以提供完整分子离子峰，提供完整的分子量信息，对蛋白质的鉴定非常有用。（可检测到的质量范围达~300,000）抗基质干扰能力强，适用于较复杂样品的分析。高灵敏度，可达pmol，甚至amol的水平检测。MALDI法的缺点：准确度不够高，只能精确值小数点后两位；不适于低分子量检测。原因：基质盐分干扰（基质峰主要出现m/z700~1000）；仪器本身的精度。质量分析器位于离子源和检测器之间，依据不同的方式将样品离子按照质荷比m/z分开。主要类型：（3）质量分析器磁分析器（MagneticSector)（包括单聚焦和双聚焦）离子肼分析器(IonTrap)飞行时间分析器(Time-of-Flight,TOF)四极滤质分析器(Quadrupole)傅立叶转化离子回旋共振分析器（FourierTransformIonCyclotronResonance,FT-ICR)以上分析器的变型和组合，如Quad-TOF，TOF-TOF单聚焦磁质量分析器依据离子在磁场的运动行为，将不同质量的离子分开进入分析器前，加速离子的动能为：mv2=2zV进入分析器后，在磁场H作用下，改作圆周运动，只有离心力与向心力相等时，离子才能飞出弯曲区，即按曲线轨迹飞行。HzvRmv=2VrHzm222=f离＝f向质谱方程式：方向聚焦：相同质荷比，入射方向不同的离子会聚；分辨率不高，适合于能量分散较小的离子源。双聚焦磁质量分析器为了消除离子能量分散对分辨率的影响，通常在扇型磁场前附加一个扇型电场（静电分析器），进入电场的离子受到一个静电力的作用，改做圆周运动：e2RmυEz=EzmυRe2=方向聚焦：相同质荷比，入射方向不同的离子会聚。能量聚焦：相同质荷比，速度(能量)不同的离子会聚。静电分析器将具有相同速度（或能量）的离子分成一类；进入磁分析器后，再将具有相同质荷比而能量不同的离子进行分离。分辨率高，但体积大。四极杆质量分析器特点：结构简单、体积小，分析速度快，适合与色谱联用分辨率较高（比磁分析器略低）准确度和精密度低于磁偏转分析器，对质量较高的离子有质量歧视反应。离子阱质量分析器双曲线表面的中心环形电极和两个端盖电极形成一个势阱——构成可变电场(与四极质量分析仪相似)——带电离子在一定轨道上旋转——改变电压——可使相同m/z离子依次离开进入电子倍增器而分离。飞行时间质量分析器利用从离子源飞出的离子其动能基本相等，但在加速电压作用下，不同m/z的离子飞行速率不一样：mzVv2=zVmLt2=质荷比小的离