细胞融合单克隆抗体

动物组织块细胞悬液原代培养（细胞贴壁；接触抑制）传代培养胰蛋白酶处理分散成单个细胞幼龄动物的器官组织；动物胚胎加入培养液用胰蛋白酶等处理贴壁细胞；分瓶继续培养。适宜条件10代细胞50代细胞传代培养细胞株无限传代细胞系遗传物质已改变遗传物质未改变动物胚胎或幼龄动物的组织、器官配置细胞悬液胰蛋白酶处理转入培养瓶单个细胞加培养液稀释分瓶原代培养原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制动物细胞培养的原理：细胞增殖体细胞核移植的过程供体细胞（供核）细胞培养体细胞卵巢卵母细胞（MⅡ中期：供质）去核去核卵母细胞注入细胞融合重组细胞构建重组胚胎胚胎移植代孕母体生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛体细胞核移植的过程共分成两大阶段：核移植和胚胎移植体细胞核移植的原理：动物细胞核具有全能性学习目标动物细胞融合单克隆抗体制备和应用白菜紫甘蓝白菜-甘蓝(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物体细胞杂交过程示意图A细胞B细胞人工诱导1.概念：杂交细胞动物细胞融合（也称细胞杂交）：是指两个或多个动物细胞结合形成一个单核细胞的过程。一、动物细胞融合融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞称为杂交细胞。正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞正在融合鸡血细胞2.动物细胞融合过程灭活病毒（常用仙台病毒）、（聚乙二醇）PEG、电激等诱导的手段？思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。细胞膜的流动性灭活病毒、PEG、电激等融合后的细胞进行有丝分裂，形成两个完整的杂交细胞诱导的手段？融合后细胞的类型？AB杂交细胞遗传物质有什么特点？三种AA、AB、BB含两种生物的遗传物质原理？3.动物细胞融合技术的意义和应用•细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。•最主要用途：利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振动、电激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、细胞全能性原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较抗体：能够与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。二、单克隆抗体B淋巴细胞效应B淋巴细胞（浆细胞）记忆B淋巴细胞分化能产生抗体的细胞是浆细胞（即效应B细胞）。强调：效应B淋巴细胞是能够产生抗体的B淋巴细胞，下文将其简称为B淋巴细胞抗体的传统生产方法抗原反复注射动物从动物的血清中分离抗体该法制备抗体的缺点：单克隆抗体！产量低、纯度低、特异性差、灵敏度低。单克隆抗体的概念•单克隆抗体：单个B淋巴细胞增殖形成的细胞群所产生的化学性质单一、特异性强、灵敏度高的抗体。2.哪种细胞是可以无限增殖的？3.有什么方法能使B淋巴细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？1.B淋巴细胞在体外培养液中能否生长增殖？（一）单克隆抗体的制备B淋巴细胞在体外不能无限增殖。肿瘤细胞B淋巴细胞与肿瘤细胞融合科勒米尔斯坦荣获1984年诺贝尔生理学或医学奖如果把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。单克隆抗体的制备过程骨髓瘤细胞小鼠一筛选已免疫的B淋巴细胞（选择性培养基）细胞融合多种杂交细胞杂交瘤细胞注射抗原聚乙二醇、灭活的病毒、电激等BB、B瘤、瘤瘤（B、瘤）√既能产生抗体又能大量增殖二筛选二筛选：能产特异性抗体的杂交瘤细胞（克隆化培养、抗体检测）阳性孔方法——抗原-抗体杂交法在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。骨髓瘤细胞免疫小鼠单克隆抗体筛选筛选体内培养体外培养已免疫的B淋巴细胞（选择培养基）（克隆化培养、抗体检测）细胞融合杂交细胞杂交瘤细胞注射抗原能产特异性抗体的杂交瘤细胞单克隆抗体的特点：特异性强、灵敏度高、产量大、纯度高腹水培养液体内优点：不需特定的培养基；不需严格外界环境条件骨髓瘤细胞免疫小鼠单克隆抗体筛选筛选体内培养体外培养已免疫的B淋巴细胞（选择培养基）（克隆化培养、抗体检测）细胞融合杂交细胞杂交瘤细胞注射抗原能产特异性抗体的杂交瘤细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术制备单克隆抗体◆利用产生特异性抗体的功能。◆利用无限增殖的特性。◆利用技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞。◆利用技术大量培养杂交瘤细胞。效应B细胞骨髓瘤细胞动物细胞融合动物细胞培养杂交细胞灭活的病毒等手段小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞经免疫的小鼠提取杂交瘤细胞第一次筛选用特定的选择性培养基第二次筛选能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞体外培养注射到小鼠腹腔提取单克隆抗体3.为何要进行两次筛选？4.如何进行第2次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。专一抗体检验呈阳性。第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。1.本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2.为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体（1）作为诊断试剂——最广泛用途准确、高效、简易、快速（如同位素标记单克隆抗体，可诊断肿瘤、心血管畸形等疾病）（二）单克隆抗体的应用用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体技术做成的“早早孕诊断试剂盒”，灵敏度高，在妊娠第8天就可以做出诊断，比原来的诊断方法提前了10天左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。（2）用于治疗疾病和运载药物主要用于治疗癌症治疗，单克隆抗体作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”，准确杀伤癌变细胞。这样既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量。“生物导弹”＝抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素单克隆抗体导向，药物为弹头利用单克隆抗体的特异性两个过程动物细胞融合过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法－－灭活病毒一个新细胞－－杂交瘤细胞一个优势－－单克隆抗体特异性强、灵敏度高，并可大量制备的优势基因型为Aa与基因型为Bb的动物体细胞混合，用灭活的仙台病毒处理后，不可能获得下列哪种基因型的细胞()A．AAaaB．AaBbC．AabbD．BBbb【例1】能使动物细胞融合的特有的诱导因子是（）A.离心B.灭活的病毒C.电刺激D.振动【例2】融合后的杂交细胞的遗传物质有何特点（）A.具有原来两个或多个细胞的遗传信息B.能无限增殖C.可形成新个体D.培养过程会贴壁【例3】动物细胞融合的作用中最重要的是（）A.克服远源杂交不亲和B.制备单克隆抗体C.培育新物种D.生产杂种细胞BBA【例4】科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（）A.经过免疫的B淋巴细胞C.经过免疫的T淋巴细胞B.不经过免疫的T淋巴细胞D.不经过免疫的B淋巴细胞【例5】单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的（）A.B淋巴细胞B．T淋巴细胞C．骨髓瘤细胞D．杂交瘤细胞AD【例6】用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下列实验步骤中错误的是（）A．将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B淋巴细胞B．用纤维素酶处理B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞C．用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合D．筛选杂交细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体B×(1)若A细胞是小鼠骨髓瘤细胞，则B细胞是取自小鼠体内的细胞，从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射_____________类物质。（2）d过程是一个_____________过程，该过程的进行常用_____________或_____________的诱导。(3)假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成种类型的C细胞，因此需用__________培养基筛选出D细胞用于培养，D细胞的名称是，其特点是_________________________________________。效应B抗原细胞融合聚乙二醇灭活的病毒选择性3既能无限增殖又能产生特异性抗体杂交瘤细胞(4)在培养时通过________分裂方式大量繁殖。D细胞体外培养需要注意的条件是（要求答5项）__________________________________。（5）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，其特点是_________________。特异性强、灵敏度高有丝无菌、无毒的环境；充足的营养；适宜的温度和pH；适宜的气体环境15、（1）单克隆抗体是指。（2）制备单克隆抗体的步骤：①将__________注入小鼠体内，从小鼠脾脏中获得淋巴细胞，其中至少1个淋巴细胞带有抗该抗原的抗体。②将步骤①获得的B淋巴细胞与步骤②培养的骨髓瘤细胞在_________________的诱导下融合。③将诱导后产生的多种细胞，放在_______培养基的多孔培养板上培养，筛选。④这样获得的杂交瘤细胞既具有B淋巴细胞_____________的能力，又具有________________的本领。⑤检测和分离带有抗X抗体的阳性细胞，培养板中每孔放一个细胞进行培养。⑥将阳性细胞进行增殖，从而制备出大量抗该抗原的单克隆抗体。化学性质单一，特异性强的抗体抗原聚乙二醇选择性无限增殖产生专一抗体（3）大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：①体外培养法，可获得10μg/mL的抗体；②动物体内诱生法可获得5~20mg/mL的抗体。你选择的方法及原因是。（4）用本法制备出的单克隆抗体仍具有局限性，因为它是用小鼠的_______细胞制备的，其化学本质是___________，应用于人体，会作为产生，解决这个问题的方法是_____________________________。大量生产选①，小规模生产选②效应B蛋白质异物免疫反应采用人的效应B细胞制备15、右图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。据图回答：（1）该方案能达到预期效果吗？。原因是______________________________________________。（2）图中②为过程，常用作为诱导剂。该细胞继承了_____________________，因此不仅能分泌___________，还有本领。不能没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生专一抗体的B淋巴细胞细胞融合灭活病毒双亲细胞的遗传物质特异性抗体大量增殖制备单克隆抗体（3）该方案的目的是_________________________。例题1：1975年，英国剑桥大学分子生物学实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，实现在体外大量生产抗体的目的。实验过程如图所示。(1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合”在一起，说明细胞膜。(2)单克隆抗体的准确定义应为()A．一类特殊抗体B．无性繁殖系C．单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体D．单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体(3)杂交瘤细胞繁殖进行的是_______分裂，其遗传性状__________。(4)单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原(病原体或癌变细胞等)并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生物导弹”这是利用了_____________。具有一定的流动性C有丝不变抗体能与抗原发生特异性结合的特点[例题2]（1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选)（）A．T淋巴细胞B．效应B淋巴细胞C．抗体D．记忆细胞（2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，正确的是(多选)（）A．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台病毒或聚乙二醇诱导B．融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克隆抗体C．体外培养时，一个B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不能