重组DNA技术1概述

DNA重组技术概述天津科技大学：罗学刚第一节DNA的重组DNARecombination基因表达的分子生物学基础一个典型的原核细胞基因结构示意图原核细胞的基因是由成百上千个核苷酸对组成的。组成基因的核苷酸序列可以分为不同区段。在基因表达的过程中，不同区段所起的作用并不相同。有的区段能够转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质的区段叫做编码区。有的区段不能转录为信使RNA，也就是说不能编码蛋白质的区段叫做非编码区。一个典型的真核细胞基因结构示意图真核细胞的基因是由编码区和非编码区两部分组成的。在非编码区上，同样有调控作用的核苷酸序列，但是真核细胞的基因结构要比原核细胞的基因结构复杂。与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子，一般不能够编码蛋白质的序列叫做内含子。5’3’增强子CAAT框TATA框转录起始点外显子1外显子2外显子3内含子1内含子2AATAAA转录终止点真核细胞基因结构示意图启动子：主要包括两个序列（1）在5’端转录起始点上游约20~30个核苷酸处有TATA框，它是一个短的核苷酸序列，是启动子中的一个顺序，它是RNA聚合酶的重要接触点，能使酶准确识别转录的起始点并开始转录。当TATA框中的碱基顺序有所改变时，mRNA的转录就会从不正常的位置开始。5’3’增强子CAAT框TATA框转录起始点外显子1外显子2外显子3内含子1内含子2AATAAA转录终止点真核细胞基因结构示意图启动子：主要包括两个序列（2）在5’端转录起始点上游约70~80个核苷酸的地方，有CAAT框，是启动子中另一个短的核苷酸序列，是RNA聚合酶的另一个结合点，它的作用还不肯定，一般认为它控制着转录的起始频率，而不影响转录的起始点。当框中的碱基顺序改变后，mRNA的形成量会明显减少。5’3’增强子CAAT框TATA框转录起始点外显子1外显子2外显子3内含子1内含子2AATAAA转录终止点真核细胞基因结构示意图增强子：在5’端转录起始点上游约100个核苷酸以远处的位置，能使转录活性增强上百倍。终止子：在3’端终止密码的下游有一个核苷酸顺序为AATAAA，AATAAA顺序和下游的反向重复顺序合称为终止子，是转录终止的信号。终止子的特殊碱基排列顺序能够阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来。反向重复顺序AUUU5’5’3’3’ATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAA模板链转录UUUUCCCCCGGGGG3’5’UUUUUAAAUUAU某基因终止子的反向重复顺序与发卡结构的形成图解DNA重组包括：同源重组细菌的基因转移与重组位点特异重组转座重组接合作用转化作用转导作用发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组受体四、转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座（transposition）。第二节重组DNA技术DNARecombinationTechnique基因工程诞生的历史背景：1973年是基因工程诞生的元年。1.1944年OswaldT.Avery等的肺炎球菌转化证明了DNA是遗传信息携带者。2.1953年JamesWatson和FrancisCrick两人提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复制的机制。3.1961-1965年,科学家破译了生物界全部64个遗传密码,发表了划时代的遗传密码字典，提出了遗传信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。4.1970年发现了反转录酶，丰富了中心法则，为cDNA的制备奠定了基础。5.染色体外DNA----质粒的深入研究，为第一批重组DNA载体提供了材料。6.1968-1970年，限制性内切酶的发现和纯化，为DNA的体外重组提供了有力的工具。7.1972年，Berg.D等人首次用限制性内切酶EcoRI切割噬菌体和SV40病毒DNA分子，将这两种不同来源的DNA片段成功地在体外连接成杂合DNA分子。至此，用重组DNA技术改变生物学性状的尝试在1973年由Cohen等人完成。从此，这项技术为生物学带来了一场深刻的革命，这类技术本身也迅速地发展起来，并广泛地渗透到各个学科的研究领域。一、重组DNA技术相关概念（一）DNA克隆克隆（clone）来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化（cloning）,即无性繁殖。技术水平：分子克隆（molecularclone）即DNA克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）内切核酸酶内切核酸酶，维持细菌遗传性状的稳定。限制性内切核酸酶或DNA结合蛋白所特异识别、结合的DNA位点的核苷酸序列，呈二元旋转对称，通常将这种特殊的结构顺序称为回文结构（palindrome）。识别序列可以是四核苷酸、六核苷酸或八核苷酸；产生的切口可以是粘性末端、平头或钝性末端、配伍末端。。５’５’３’３’５’５’５’５’５’５’５’５’３’３’３’３’３’３’３’３’(三)目的基因目的基因：用来扩增作研究或生产某一种蛋白质的基因。就是在重组DNA时，人们感兴趣的基因或DNA序列，又称目的DNA(targetDNA)。类型：cDNA(complementaryDNA)：指经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA，经聚合可合成双链cDNA。基因组DNA(geneticDNA)：指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。大容量载体柯斯质粒载体酵母人工染色体载体质粒DNA的提取及鉴定1．收获细菌2．碱裂解法小量抽提质粒（1）将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/lTris–HClpH8.0,10mmol/LEDTA）中，剧烈振荡。（2）加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/lNaOH,1%SDS），缓和振荡，水浴5min。（3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/LKAC60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。（4）4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。（5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀（6）用2倍体积无水乙醇室温沉淀DNA，室温放置2min。（7）4℃以12000g离心5min。（8）小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。（9）用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。（10）加50μl的1×TE（含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶），振荡，贮存于-20℃。聚合酶链反应（PCR）PolymeraseChainReaction基本原理：变性、退火、延伸感受态细胞：指具备接受外源DNA能力的宿主细胞导入大肠杆菌1.氯化钙转化法2.电击法3.体外包装感染法导入哺乳动物细胞1.显微注射法2.电穿孔法3.DNA-磷酸钙共沉淀4.DEAE-葡聚糖转染法5.病毒感染法6.脂质体介导法7.细胞融合法8.原生质体融合法9.微细胞介导法大肠杆菌感受态的制备（1）接种单菌落于2mlLB培养液中，37℃过夜。（2）取0.25ml过夜菌入25mlLB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。（3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。（4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。（5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5mlEppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。重组DNA的转化（1）将3只Eppendorf管按下列组作好标记，然后按下述进行：转化组：受体菌＋重组DNA阴性对照组：受体菌阳性对照组：受体菌＋阳性DNA（2）冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。（3）42℃90s。（4）37℃水浴5min。（5）加入无相应抗生素的Lb200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。（6）分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。(五)重组体的筛选直接选择法1.抗药性选择2.标志补救3.分子杂交法间接筛选法核酸水平*1.酶切图谱*2.核酸探针*3.PCR*4.序列测定蛋白质水平免疫学的技术：SDS-PAGE、Westernblot、ELISA、放免、免疫沉淀、荧光抗体等（六）克隆基因的表达表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化１、原核表达体系２、真核表达体系第三节重组ＤＮＡ技术与医学的关系（一）疾病基因的发现与克隆（二）生物制药（五）遗传病的预防１、产前诊断２、携带者测试３、症候前诊断４、遗传病易感性预测