重组人促甲状腺激素琢亚基在大肠杆菌中的表达

天津医药圆园10年3月第38卷第3期促甲状腺激素（贼澡赠则燥蚤凿原泽贼蚤皂怎造葬贼蚤灶早澡燥则皂燥灶藻，栽杂匀）是腺垂体促甲状腺细胞分泌的一种异二聚体糖蛋白，由琢和茁亚基以非共价键结合组成[1]。TSH的琢亚基与其他糖蛋白激素分子———卵泡刺激素（枣燥造造蚤糟造藻泽贼蚤皂怎造葬贼蚤灶早澡燥则皂燥灶藻，云杂匀）、黄体生成素（造怎贼藻蚤灶蚤灶早澡燥则皂燥灶藻，蕴匀）以及绒毛膜促性腺激素（糟澡燥则蚤燥灶蚤糟早燥灶葬凿燥贼则燥责蚤灶，悦郧）的琢亚基相同，只是茁亚基各异，赋予其不同的生物学和免疫学特征[2]。Graves病（郧则葬增藻泽凿蚤泽藻葬泽藻，GD）又称弥漫性毒性甲状腺肿，是一种伴甲状腺激素（贼澡赠则燥蚤凿澡燥则皂燥灶藻，栽匀）分泌增多的器官特异性自身免疫性疾病[3]，其病因和发病机制尚未完全阐明。在免疫学方面认为其发病可能与TSH成为自身抗原，刺激机体产生自身抗体有关。为探索TSH在GD免疫网中作用，需要大量的人类TSH。本实验以基因工程方法生产重组人TSH琢（rhTSH琢），为下一阶段研究GD的发病机制打下基础。1材料与方法1.1材料RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司；M-重组人促甲状腺激素琢亚基在大肠杆菌中的表达*熊蔚俐孙蓓曹晓娜马精彩张镜宇郭刚吟摘要目的：构建pGEX-3X/hTSH琢大肠杆菌表达系统，制备重组人促甲状腺激素琢（TSH琢）亚基。方法：Trizol法提取新鲜人绒毛膜组织总RNA，将1滋g总RNA逆转录合成cDNA并以之为模板进行PCR扩增hTSH琢亚基的完全编码序列。EcoRI和BamHI双酶切将所扩增的hTSH琢基因定向克隆入表达载体pGEX-3X，转化感受态大肠杆菌Mach1-T1，IPTG诱导表达融合蛋白GST-rhTSH琢。离心收集菌体，超声碎菌后获得包涵体。以梯度浓度降低的尿素溶液洗涤，8mol/L尿素溶液溶解包涵体。包涵体溶解液经透析后复性进行SDS-PAGE鉴定及竞争性ELISA抗原性分析。结果：DNA序列分析证实重组pGEX-3X/hTSH琢质粒含有读码框正确的hTSH琢基因。PAGE显示重组质粒可表达产生36ku大小的特异蛋白条带。ELISA结果表明，所表达的融合蛋白具有与抗人TSH琢抗体相结合的能力。结论：成功构建了重组pGEX-3X/hTSH琢表达载体，其产物具有hTSH琢抗原性。关键词糖蛋白激素类,琢亚单位克隆,分子重组,遗传基因表达大肠杆菌ExpressionofRecombinantHumanThyroidStimulatingHormoneSubunit琢inEscherichiaColiXIONGWeili,SUNBei,CAOXiaona,MAJingcai,ZHANGJingyu,GUOGangKeyLabofHormonesandDevelopment,InstituteofEndocrinology/HospitalofMetabolicBisease,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,ChinaAbstractObjective:ToconstructpGEX-3X/hTSH琢Escherichiacoli(E.coli)expressionsystemandpreparepurifiedrecombinantGST-recombinanthumanthyroidstimulatinghormone(rhTSH)琢protein.Methods:Thecompletecodingse鄄quenceofhTSH琢wasobtainedbyRT-PCRwithtotalRNAextractedfromfreshchorialtissueasthetemplate,andthereafterclonedintoexpressionvectorpGEX-3XbyEcoRIandBamHIdigestion.TherecombinantplasmidwastransformedintoE.coliMach1-T1andtheninducedexpressionbyIPTG.TheGST-rhTSH琢fusionproteinwasidentifiedbySDS-PAGEanditsanti鄄genicitywasverifiedbyamodifiedcompetitiveELISA.Results:Aspecificproteinbandof36ku,inaccordancewithpredict鄄edmolecularweight,couldbevisualizedinSDS-PAGE.AstheresultofELISA,therecombinantGST-hTSH琢proteincanin鄄hibittheintactTSHmolecularbindingwithanti-TSH琢antibodyinadosedependentmanner.Conclusion:ThecDNAofhTSH琢wasclonedandtherecombinantexpressionvectorpGEX-3X/hTSH琢wasconstructedsuccessfully.TherecombinantGST-rhTSH琢proteincouldbehighlyexpressedinE.coliMach1-T1andwasapprovedofpossessingantigenicity.Keywordsglycoproteinhormones,alphasubunitcloning,molecularrecombination,geneticgeneexpressiones鄄cherichiacoli*天津市“重中之重”学科建设专项基金资助项目（项目编号：05YFGDSF0700）作者单位：300070天津医科大学代谢病医院内分泌研究所、卫生部激素与发育重点实验室吟通讯作者E-mail:[e-mail]167栽蚤葬灶躁蚤灶酝藻凿允熏Mar圆园10熏灾燥造38晕燥3MLV逆转录酶购自PROMEGA公司；表达载体pGEX-3X、DNA回收试剂盒购自QIAgen公司；限制性内切酶EcoRI和BamHI购自TaKaRa公司；KOD-Plus高保真DNA聚合酶购自TOYOBO公司；大肠杆菌Mach1-T1菌株、核酸分子质量标志物DL2000plus、dNTP、T4DNA连接酶购自北京全式金公司；其余试剂为进口或国产分析纯。PCR引物用GeneRunner软件设计，委托北京奥科生物技术有限公司合成。1.2方法1.2.1逆转录PCR扩增hTSH琢cDNATrizol法提取新鲜人绒毛膜组织总RNA（按Trizol试剂说明书操作）。取总RNA3滋g，Olig燥（凿栽）员愿园援圆5滋g，在200UM-MLV逆转录酶的作用下合成cDNA。以cDNA为模板，上游引物5忆-GGGGATCCGGGCTCCTGATGTGCA-3忆，下游引物5忆-GGGAATTCTTAAGATTTGTGATA-3忆进行PCR。反应条件为94益5min预变性，94益30s、56益30s、72益30s，35个循环，72益延伸10min。PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收试剂盒纯化回收PCR产物。1.2.2重组pGEX-3X/hTSH琢表达载体的构建将纯化的PCR产物和pGEX-3X质粒分别用EcoRI和BamHI进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收所需DNA片段。回收产物用快速T4DNA连接酶25益反应10min，连接产物转化感受态大肠杆菌Mach1-T1。次日挑取数个单菌落，碱法提取质粒，以EcoRI/BamHI双酶切筛选出重组质粒，进行DNA序列分析。1.2.3重组蛋白的诱导表达及包涵体的处理挑取重组菌落，37益震荡培养至OD600达到0.6~0.8，IPTG诱导表达5h。离心收集菌体，超声碎菌后离心分离上清和沉淀，各取少量进行SDS-PAGE分析。包涵体的处理：依次用含0.5、1、2mol/L尿素的洗涤液（园.1%TritonX-10园，员mmol/LEDT粤，园.5~2mol/L尿素,50mmol/LTris-H悦造，责H8援园）洗涤包涵体；用变性液（愿皂ol/L尿素,100mmol/LNaC造，员mmol/LEDTA，缘园mmol/LTris-H悦造，责匀愿援园）充分溶解包涵体；包涵体溶解液用浓度梯度降低的尿素溶液（4、2、1mol/L尿素,50mmol/LNa悦造，缘园mmol/LTri泽原匀悦造，责匀愿援缘）进行透析，每个浓度透析远澡，之后换用孕月杂透析过夜。以月杂粤为参照BCA法对透析后的溶液进行总蛋白浓度的测定。1.2.4表达产物的抗原性鉴定以人血清TSHELISA测定试剂盒完成，对原有步骤加以改造。在包被有抗人TSH茁亚基抗体的孔板中加入不同浓度的人TSH标准品以建立标准曲线，另取24孔加入已知高TSH浓度（80mIU/L）的同一样本，室温孵育1h后充分洗涤孔板；于标准品孔中加入HRP标记的抗人TSH琢亚基抗体；24个样本孔中在加入上述抗体的同时加入不同浓度所制备的重组人TSH琢（0、25、50、100、250、500、1000、2000mg/L），共8个浓度,每个浓度设3个复孔。室温孵育1h后充分洗涤孔板，加入底物溶液显色15min后以1mol/L硫酸溶液终止反应。450nm比色并计算各孔所测得的TSH浓度。2结果2.12%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物成功扩增出与预期长度相符的280bp的DNA片段，见图1。2.2重组质粒的酶切鉴定经双酶切，可见分别为280bp的目的片段和约5000bp的线性化质粒。DNA序列分析证实该重组质粒内含有读码框正确的hTSH琢基因，见图2。2.3重组质粒pGEX-3X/hTSH琢的表达以含空pGEX-3X质粒的宿主菌为对照，重组质粒pGEX-3X/hTSH琢转化菌诱导表达后，在36ku附近出现深染条带，主要以包涵体形式存在，见图3。包涵体经处理之后，纯度显著提高，见图4。2.4抗原性检测加入到反应体系中的重组TSH琢蛋白可以抑制抗人TSH琢抗体与孔板上所捕获的TSH相结合，导致测定值显著低于实际浓度（80mIU/L），见表1。1：DNAMarkerDL2000plus；2：hTSH琢PCR扩增产物图1hTSH琢PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳1：DNAMarkerDL2000plus；2：重组质粒pGEX-3X/hTSH琢经BamHI和EcoRI双酶切产物图2重组质粒pGEX-3X/hTSH琢的酶切鉴定168天津医药圆园10年3月第38卷第3期1：Mach1-T1空菌37益诱导表达，碎菌上清；2：Mach1-T1空菌37益诱导表达，碎菌沉淀；3：pGEX-3X转化Mach1-T137益诱导表达，碎菌上清；4：pGEX-3X转化Mach1-T137益诱导表达，碎菌沉淀；5：pGEX-3X/hTSH琢转化Mach1-T1未诱导表达，碎菌上清；6：pGEX-3X/hTSH琢转化Mach1-T1未诱导表达，碎菌沉淀；7：pGEX-3X/hTSH琢转化Mach1-T137益诱导表达，碎菌上清；8：pGEX-3X/hTSH琢转化Mach1-T137益诱导表达，碎菌沉淀；9：蛋白质分子质量标志自上而下分别为250、130、100、70、55、35、27ku图3重组hTSH琢表达产物的SDS-PAGE3讨论免疫学方面，在GD患者血清中能够检测到甲状腺特异性抗体，针对其来源提出了独特型—抗独特型免疫网络学说[4]。该学说认为这种免疫球蛋白是由于机体免疫系统功能缺陷，导致体内TSH成为自身抗原而刺激免疫系统产生TSH抗体（TSHAb1），继而TSHAb1又诱导相应的免疫球蛋白TSHAb2产生。这种TSHAb2具有与TSH结构相似或完全相同的主体结构型，可与TSHR结合，模拟TSH样生物活性，从而导致甲状腺功能异常。因此，获得TSH琢蛋白，进一步制备hTSHAb1、hTSHAb2，建立GD的动物模型，对