重组人纤维连接蛋白对无血清培养的CIK细胞增殖及对K562细胞杀伤活性

重组人纤维连接蛋白对无血清培养的CIK细胞增殖及对K562细胞杀伤活性的影响徐本玲1，袁龙2，高全立3，张成娟1，张旭华1，范瑞华1，宋永平1（郑州大学附属肿瘤医院，河南省肿瘤医院：1.中心实验室；2.生物治疗科；3.普外科，河南郑州450008）摘要：目的探讨重组人纤维连接蛋白(RetroNectin,RN)诱导的细胞因子诱导的杀伤细胞CIK增殖、免疫特性及对人类K562细胞杀伤活性的影响。方法密度梯度分离法分离外周血单个核细胞后分成两组，应用CD3单抗、IFN-γ、IL-2培养CIK细胞，一组含RetroNectin（RN组），一组不含RetroNectin（Non-RN组）。记录两组细胞增殖速度；用流式细胞术动态测定免疫细胞表型；用CBA细胞因子试剂盒检测IFN-γ，TNF-α及IL-4的分泌；用CFSE/PI双标法测定CIK细胞对人红白血病细胞株（K562）的体外杀伤活性。结果RN组细胞生长明显快于Non-RN组（P0.05）；CD3+CD8+的细胞随着时间的延长逐渐增多，但两组间比较无统计学差异；CD3+CD56+细胞所占百分比在第5天和第10天时两组间比较均无统计学差异(P0.05)，在第15天时RN组有大幅度升高，第15、20、25天两组比较均有统计学差异(P0.05)。细胞毒杀伤活性结果显示，RN组与Non-RN组对K562细胞毒活性亦有统计学差异。两组间细胞因子IFN-γ、TNF-α随着培养时间的延长，分泌量逐渐升高。结论使用RN诱导的CIK细胞增殖速度快，杀伤肿瘤细胞活性高，是一种安全高效的细胞培养方法。关键词：纤维连接蛋白；细胞因子诱导的杀伤性细胞；无血清培养；K562细胞中图分类号：R734.2文献标志码：A文章编号：1671-8259InfluenceoftherecombinantRetroNectinonthebehaviorofCIKcellsinserum-freeculturemediumXUBen-ling1,YUANLong2,GAOQuan-li3,ZHANGCheng-juan1,ZHANGXu-hua1,FANRui-hua1,SONGYong-ping1收稿日期：2011-03-07修回日期：2011-04-27基金项目：河南省卫生厅医学科技重大攻关资助项目（No.201001013）。SupportedbytheKeyScienceandTechnologyFoundationofHenanProvince(No.201001013)作者简介：徐本玲（1977-），女（汉族），主治医师。研究方向：肿瘤的生物治疗。E-mail:[e-mail]:61-1399/R.20110617.1135.0102011-06-1711:35通讯作者：袁龙（1976-），男（汉），主治医师，研究方向：肿瘤的综合治疗，E-mail:[e-mail](1.LaboratoryCenter;2.DepartmentofBiotherapy;3.DepartmentofGeneralSurgery,ZhengzhouUniversityAffiliatedTumorHospital/HenanProvincialTumorHospital,Zhengzhou450008,China)ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheeffectofRetroNectinontheproliferation,immunologiccharacteristicsandcytotoxicityofcytokine-inducedkillercells(CIK).MethodsPeripheralbloodmononuclearcells(PBMC)werecollectedfromhealthydonorsanddividedintotwogroups:RNgroupandNon-RNgroup.TheproliferationofCIKcellswastestedbycytometircanalysis.ThecytotoxicactivityofCIKcellswasdeterminedbyCFSE/PIdouble-labelingassays.ThecytokinesecretionprofileofRNgroupandNon-RNgroupwasanalyzedbyBDTM-CBAHumanTh1/Th2kit.ResultsTheRN-inducedgrouphadahigherproliferationratethanthatoftheNon-RNgroup(P0.05).ThetwogroupsdifferedsignificantlyinCD3+CD56+cellsatthefifthday(P0.05),andthesignificantdifferencewsmaintainedtillthe25thday;buttherewasnosignificantdifferencebetweenthetwogroupsinCD3+CD8+Tcells(P0.05).CytotoxityandthesecretionprofileofIFN-γandTNF-αdifferedsignificantlybetweenthetwogroups.Astheculturetimewenton,thesecretionamountofIFN-γandTNF-αwasincreased.TherewasnosignificantdifferencebetweenthetwogroupsintheamountofIL-4.ConclusionRetroNectinplusserum-freecultureisasafeandeffectivewaytocultureCIKcellsbecausetheyhavefasterproliferationrateandhighcytotoxicactivity.KEYWORDS:RetroNectin;cytokine-inducedkiller(CIK)cell;serum-freeculture;K562cell随着细胞治疗产品的快速发展，体细胞治疗的安全性日益受到关注。为了保证受者和公众的安全，防止感染性试剂通过细胞治疗产品进行传染是非常重要的。血清对细胞粘附、存活、生长及维持其功能非常重要，是一种非常有效的添加剂，但动物来源的血清可能含有传染性物质或致人类过敏[1-2]。由于血清是由蛋白、糖、脂质、维生素等成分组成，它的质量受来源动物的遗传基因、生长环境等因素的影响，也就是说血清制品的成分和功能会有非常大的可变性。这种可变性会进而影响细胞治疗产品的一致性[3]。而采用无血清培养有助于提高细胞的一致性，是一种理想的制备细胞治疗产品的方法[4]。在进行无血清培养时，蛋白因子往往需要加入无血清培养基中以代替血清的功能，而加入的蛋白必须不会增加感染的风险。重组人纤维连接蛋白（RetroNectin,RN）参与淋巴细胞的附着、伸展、分化和增殖，该产品已注册美国药典和国际专利。本研究拟观察RetroNectin对无血清培养细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）的生物学活性的影响，以寻找一种快速、简便、安全的符合临床标准的CIK培养方法。1材料与方法1.1试剂干扰素(IFN-γ)为上海克隆生物高技术有限公司产品；重组人IL-2为山东泉港药业有限公司产品；RetroNectin，GT-T551无血清培养基(人淋巴细胞培养基)及GT-T610培养袋均为北京宝日医生物技术有限公司产品；CD3MAb购于北京宝日医生物技术有限公司,由古巴分子免疫学中心研制生产；FITC/CD4-PE/CD3-PC5及CD3-FITC/CD56-PE/CD16-PC5、BDTM-CBAHumanTh1/Th2型细胞因子试剂盒购自美国BD公司；CellTraceTMCFSECelllProliferationKit（C34554）购自Invitrogen（USA）。1.2CIK细胞的体外培养、扩增及存活率测定在知情同意情况下，抽取3例健康人（年龄37~57岁）外周静脉血每人50mL，用淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞（PBMCs），每份血样的PBMCs分为2份，以1×107/每瓶接种培养瓶，应用CD3单抗、IFN-γ、IL-2培养CIK细胞。一组含RN（RN组），一组不含RN（Non-RN组）。RN组：RN(5ug/mL)和抗CD3mAb（5μg/mL），提前24h包被培养瓶，培养当天加入重组人IFN-γ（1000u/mL）、IL-2（1000u/mL）；Non-RN组：提前24h只用抗CD3mAb（5μg/mL）包被培养瓶，其余步骤同RN组。RN刺激4d后,将2组培养瓶中的细胞完全吹打下来后转移到GT-T610培养袋中，扩充培养基体积至4~6倍,以后根据细胞生长状态，3~5d补加入IL-2（1000u/mL）和GT-T551无血清培养基，CIK细胞培养第15天开始回收,余分袋培养。1.3显微镜下细胞形态的观察在诱导过程中每天于显微镜下观察两组CIK细胞形态的变化。1.4CIK细胞增殖活性的测定用注射器随机抽取培养袋中的CIK细胞1mL，3次，混匀，用胎盘蓝计数细胞总数计算平均值，每3d1次,根据细胞增殖倍数绘制生长曲线。1.5CIK细胞表型的测定在诱导过程的5、10、15、20、25d，分别取2×106/mL细胞于流式专用管中，相应抗体混匀4oC避光放置20min，PBS洗2遍,1500r/min离心5min，10mL/L甲醛固定后上机测定检测两组细胞中CD3+CD56+、CD3+CD8+、CD3+CD4+的细胞比例。结果分析采用CellQuestPro软件。1.5细胞因子的测定在诱导过程的5、10、15、20、25d，用注射器分别抽取培养两组培养袋中的CIK细胞3mL，以1×106/孔接种24孔板，培养24h，收集上清检测细胞因子的分泌情况。操作严格按BDTM-CBAHumanTh1/Th2型细胞因子试剂盒说明书进行：①配置标准管。②绘制标准曲线：用TOP至1∶256各标准管的流式结果绘制IL-4、IFN-γ细胞因子的标准曲线。③配置测试管：取人类IL-4、IFNγ捕获珠液各10μL，混匀，200g离心5min，去上清液；用血清增强缓冲液加至60μL，混匀，避光30min；取50μL加入测试管，加入50μL藻红蛋白阳性对照测试液，加入50μL人类Th1/Th2型细胞因子标准稀释液，加入50μL培养上清标本，混匀，避光3h；加入1mL洗涤缓冲液，200×g离心5min，去上清液；加入300μL洗涤缓冲液，上流式细胞仪检测。④用CBA软件在标准曲线下得出各测试管IL-4、IFNγ的含量。1.6靶细胞人红白血病细胞的培养红白血病细胞系K562（郑州大学附属肿瘤医院中心实验室长期保存传代），常规细胞培养，选对数生长期的细胞用于细胞毒性实验。1.7采用CFSE/PI双标法检测CIK细胞对K562细胞的杀伤活性将靶细胞转移至50mL离心管中，离心收集细胞，然后用PBS重悬洗涤2次，期间计数所要收集的靶细胞。将预温好的CFSE-PBS液加入细胞团中（CFSE终浓度为1.25μmol/L），轻轻吹打悬浮细胞（细胞密度1×106/mL）。37C放置细胞5min。加入10mL含100mL/LFCS的1640培养基终止反应，然后离心细胞。加入10mL含100mL/LFCS的1640培养基,37C放置30min。PBS洗涤2次，最后用1640培养基重悬细胞，细胞终密度为5×105/mL。分别取两组培养第15天的细胞30mL做为效应细胞，调整效应细胞的密度为5×106/mL。在15mL离心管中将效