5-目的基因的重组导入

第五章目的基因导入受体细胞外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组DNA分子，该重组DNA分子必须导入适宜的受体细胞中方能使外源目的基因得以大量扩增或表达。外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞基因的重组与转移DNA体外连接应注意的事项：1.插入片段与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。决不能进行非互补粘性末端连接。第一节、DNA片段的体外连接EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3A、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。2.DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI•当外源DNA以非定向的方式插入克隆载体时，需用测序或酶切的方法确定插入方向，上述两种方法或昂贵或费力。一种快速、简便的PCR法，即利用载体的通用引物和目的片段的两个特异性引物直接扩增重组菌落，从而达到鉴别DNA插入方向的目的。3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定位插入载体（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片段EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变！4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片段的用量（2）用碱性磷酸酶处理载体5’3’载体插入片段载体和外源DNA插入片段的连接结果受体细胞：原核生物细胞真核生物细胞酵母菌细胞植物细胞动物细胞第二节、重组DNA导入大肠杆菌大肠杆菌受体细胞的选择1、重组缺陷型：避免与受体基因组进行同源重组，便于重组DNA独立存在2、限制缺陷型:避免修饰和降解，使重组DNA稳定存在易于转化或转导：提高细胞的通透性，较高的转化率4、遗传互补型：有明显的选择性差异，有利于重组体筛选具有较好的翻译后加工，有利于真核基因表达6、感染缺陷型：防止感染，安全性高，无致病基因使用丧失了限制修饰体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。1.菌种，大肠杆菌，枯草杆菌，蓝细菌2.外源DNA导入细菌的几种方法（1）转化（transformation)通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。（2）转染（transfection)噬菌体、病毒或以它们为载体构建的DNA重组体直接导入受体细胞而获得新的遗传表型。当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。（3）转导（transduction)用CaCl2处理大肠杆菌，细菌表面正电荷增加，细胞壁和膜的通透性增加，利于DNA分子的吸附和吸收能增加膜的通透性。3、感受态大肠杆菌的制备当细菌处于0℃、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态；此时转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNA在42℃短时间热冲击后吸附在细胞表面而利于进入，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。制备原理制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬3.重组质粒导入受体的转化方法大肠杆菌在0℃CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，球状细胞复原并分裂增殖。在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。（1）热激法或热休克转化法(Heatshocktransformation)10ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置10分钟42ºC1.5分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（2）电转化法转化效率高（高于109/gDNA）。在高压脉冲下，外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于DNA等大分子进入。脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L电转仪调为2.5kV,25F脉冲控制器200-4000.5g质粒DNAOnice混合加入1mLSOC培养液37°C中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化（3）平板培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜环形重组质粒质粒自我连接线性载体或DNA片段进入细菌会被降解。①环形质粒数（1）重组质粒4.转化率和影响转化率的因素每gDNA转化成功的细菌克隆数总受体细胞所获的转化成功的细菌数①生长状态对数生长期的菌②4℃④储存感受态菌要在-70℃以下③CaCl2处理要充分⑤使用感受态菌时必须迅速融化（2）感受态细胞（competentcells)转化率高的菌株；有突变的菌株（互补）；不育的菌株（不会接合）一、酵母细胞1.菌株选择如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31三、重组DNA导入真核细胞（1）利用原生质体进行转化2.酵母的转化方法酵母原生质体感受态蜗牛消化酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的重组载体转化酵母0.1mol/LLiCl处理插入外源基因的重组载体感受态40%PEG4000（2）利用Li+盐进行转化消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗二、植物细胞1.农杆菌介导法植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-2kV,3-25F电击愈伤组织幼苗分化2.电击法（electroporation)又称高速微型子弹射击法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m钨弹头吸附基因枪射击植物装入3.基因枪法（genegun）（1）原理：三、哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀，倒入培养细胞平皿，DNA和磷酸钙形成共沉淀物，黏附到培养的哺乳动物单层细胞表面，就可被细胞捕获。依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。不需要载体。（2）特点：脂质体(liposomes)是一种人造磷酸双分子膜。包装成脂质体的SV40DNA的感染性，至少要比其裸露DNA高出100倍，用它包装的DNA在4℃可长期保存不失活性，可保护DNA免受核酸酶的降解作用。以脂质体为载体的基因转移通常是先用PEG处理培养的动物细胞，使之易于吸收脂质体。正常情况下，每个细胞平均可吸收1000个左右。2.脂质体（lipofectin）载体法脂质体有商业试剂盒（如LifeTechnologies）。脂质体包埋DNA，通过与细胞膜融合进入细胞直接把外源DNA注射到宿主雄细胞核里，使其整合到染色体上。3.显微注射法(microinjection)二乙胺乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran,DEAE-dextran)是一种高分子多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA。其机理可能是因为葡聚糖与DNA形成复合物而抑制了核酸酶对DNA的作用，也可能葡聚糖与细胞结合而引发了细胞的内吞作用。DEAE-dextran转染主要有2种不同的方法。一种是受体细胞先用DEAE-dextran溶液预处理，然后再与转染的DNA接触；另一种是先使DNA直接同DEAE-dextran混合，形成DNA/DEAE-dextran复合物后，再用来处理细胞。4.DEAE---葡聚糖转染法细胞外源DNA预处理摄入DEAE外源DNA细胞混合DEAE对细胞有毒!葡聚糖二乙氨乙基葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。12吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。本章思考题（3）1、重组DNA分子在导入受体前如何保证插入的正确？2、受体的选择有什么要求？3、导入大肠杆菌受体的方法有哪些？4、导入植物细胞的方法有哪些？5、导入动物细胞的方法有哪些？6、简述各种重组DNA导入法的优缺点。