第七章微生物生长和环境

Chapter7微生物的生长与环境条件掌握：1、微生物生长的测定方式2、细菌纯培养生长曲线各个时期的主要特点3、物理、化学手段控制微生物生长的方法及原理重点：细菌纯培养生长曲线难点：利用细菌纯培养生长曲线的对数生长期计算代时第一节微生物生长的测定第二节细菌的群体生长繁殖第四节微生物生长繁殖的控制第三节真菌的生长二.细菌群体生长的测定一.获得纯培养的方法第一节微生物生长的测定一、获得纯培养的方法在自然界微生物总是混杂地生活，要想研究某一种微生物，必须把研究对象从混杂群体中分离出来。在实验条件下，从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养（pureculture）稀释分离法1.稀释平皿分离法2.平皿划线分离法单细胞挑取法纯培养分离中选择性培养基的利用富集培养的利用获得纯培养的方法1、稀释平皿分离法由一个或少数几个细菌在固体培养基上形成的肉眼可见的集落菌落涂布平皿法倾注平皿法稀释平皿分离法2、平皿划线分离法分区划线法连续划线法划线分离稀释分离法1.稀释平皿分离法2.平皿划线分离法单细胞挑取法纯培养分离中选择性培养基的利用富集培养的利用获得纯培养的方法选择性培养基的利用抑制大多数其它微生物的生长使待分离的微生物生长更快使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养!!!根据所要分离的菌种的特性选用培养基：①分离真菌用马丁培养基，pH偏酸；分离放线菌用高氏1号，pH中性偏碱。②根据不同菌对化学试剂的敏感性：分离放线菌，培养基中加10%酚，抑制细菌、真菌；从土壤中分离真菌，加孟加拉红，抑制细菌生长。③根据分离对象的营养特征：分离能发酵纤维素的菌株，培养基以纤维素为唯一碳源。分离固氮菌，用无氮培养基。二、细菌群体生长的测定高等生物：生长：个体体积的增大繁殖：个体数量的增加。对于丝状微生物如放线菌、霉菌：生长：菌丝伸长、分枝。繁殖：产生孢子，孢子萌发为菌丝体。对于细菌、酵母等单细胞微生物来说，个体增大是有限度的，测定单个细胞生长没有大的意义。微生物生长主要是指群体数量的增加，微生物的生长通过繁殖表现出来。细菌的生长和繁殖难以分开，因此，常以群体生长作为细菌生长的指标细菌群体生长测定一般采用细胞数量和生物量两种方法微生物生长是群体生长:表现为细胞数量的增加和生物量的增长!!!（一）细胞数量的测定细胞总数的测定（包括活的和已丧失活力的细菌，又名直接计数法）1、显微直接计数法2、比浊法3、染色涂片计数法采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。1、显微直接计数法不能区分死菌与活菌不适于对运动细菌的计数需要相对高的细菌浓度个体小的细菌在显微镜下难以观察缺点2、比浊法比浊法的原理是利用细菌细胞在溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中测定时所吸收的光线越多3、染色涂片计数法取0.01ml的菌悬液放在1cm2的玻片上，让其干燥，然后固定染色，再置显微镜下计数每一视野中的菌数，算出视野面积，按下列公式即可求出每ml原菌液中的含菌数。每ml原菌液中的含菌数=视野中的平均菌数×1cm2/视野面积×100×稀释倍数活菌数量的测定（间接计数法）1、稀释平板测数法2、最大概率法（MPN法）3、薄膜过滤计数法1、稀释平板测数法以CFU(colonyformingunits)表示倾注平板法涂布平板法操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！采用培养平板计数法要求操作熟练、准确，否则难以得到正确的结果：样品充分混匀每支移液管及涂棒只能接触一个稀释度的菌液同一稀释度三个重复,取平均值每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数2、最大概率法方法是：将待测菌液于液体中作十倍系列稀释，每稀释度做3—5个重复，经培养后，检查细菌的生长，以有细菌生长的最后三个稀释度的管数作数量指标，由数理统计表查出近似值，再乘以数量指标第一位的稀释倍数，即为原菌液中的菌数。例如：某细菌在稀释培养法中生长情况如下：稀释度：10—3，10—4，10—5，10—6，10—7，10—8重复数：555555有菌生长管数：555410根据上述结果，数量指标为“541”，查表得近似值为17，乘以第一位数的稀释倍数，得出原始培养物的活菌数=17×105个菌数低样品（如水）→膜过滤→培养→菌落计数如何对菌数低的样品，如水，中的细菌数量进行统计？用于计数空气或水中的含菌数3、薄膜过滤计数法测定细胞干重法单位体积培养物中细胞物质的干重含氮量测定法微生物细胞中蛋白质的含量是比较稳定的，测出微生物细胞中的含N量后再换算出蛋白质的含量，可用凯氏定N法。蛋白质的含量=氮量×6.25DNA含量的测定ATP含量的测定（二）细胞生物量的测定代谢活性法根据微生物生命活动的强度来估算生物量。如单位体积培养物在单位时间内的O2消耗、糖消耗或产酸产CO2量等，它们在一定程度上间接地反映细胞生物量。将少量纯培养微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。分批培养（batchculture）or封闭培养（closedculture）生长：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期第二节细菌的群体生长繁殖批量培养是实验室常采用的方法，即细菌在一定体积的培养基中生长，经历了消长的生活周期以少量的纯培养细菌接种有限的液体培养基，并在培养过程中定时取样测数，可以发现细菌群体的生长有一定的规律。若以时间为横坐标，以活菌数的对数为纵坐标，可以绘出一条类似于S形的曲线，该曲线称为细菌纯培养的生长曲线菌数的对数细菌纯培养的生长曲线延缓期对数期稳定期衰亡期一个典型的生长曲线分为延缓期，对数期，稳定期和衰亡期四个时期在这个时期内,菌体体积增长较快,如巨大芽孢杆菌可以从3.4μm增长到9.1—19.8μm。细胞内原生质比较均匀一致，贮藏物质消耗，DNA含量提高，产生各种诱导酶，在这个时期的后阶段，菌体细胞逐步进入生理活跃期，少量菌体开始分裂，曲线稍有上升。滞留期的长短，因菌种和培养条件不同而异，几分钟到几小时不等。不同微生物的适应期不同延缓期lagphase（滞留适应期）对数期logarithmicgrowthphase细菌生长旺盛，代谢活力强。分裂速度快，菌数以指数级数增加生长曲线表现为一条上升的直线，代时稳定。细胞在形态、生理等方面较为一致，是研究微生物生理代谢和遗传变异的好材料。在工业生产中也用对数期细胞作为扩大培养的种子液在对数生长期内，细菌数目的增加是按指数级数增加的，即20→21→22→23……2n这里的指数n为细菌分裂的次数或者增殖的代数，也就是一个细菌繁殖n代产生2n个细菌如果在对数期开始时间t1的菌数为x1，繁殖n代后到对数期后期t2的菌数为x2，则x2=x1·2n代时(Generationtime,G)（即每增加一代所需要的时间）:G=（t2-t1）/nx2=x1·2nlgx2=lgx1+nlg2n=（lgx2-lgx1）/lg2n=3.3·lg(x2/x1)G=[t2-t1]/[3.3·lg(x2/x1)]稳定生长期特点：又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度，又逐渐趋向零(stationaryphase)在一定容积的培养基中，细菌为什么不能按对数期的高速率无限生长呢?由于对数期细菌活跃生长引起周围环境条件条件发生了一系列变化，某些营养物质消耗，有害代谢产物的积累，以及诸如pH、氧化还原电位、温度等的改变，限制了菌体细胞继续以高速度进行生长和分裂稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽胞细菌也在此阶段形成芽胞。如果为了获得大量菌体，就应在此阶段收获，因这时细胞总数量最高也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期稳定期的微生物，在数量上达到了最高水平，产物的积累也达到了高峰，此时，菌体的总产量与所消耗的营养物质之间存在着一定关系，这种关系生产上称为产量常数细菌死亡率逐渐增加，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”。其中有一段时间，活菌数呈几何级数下降，故有人称之为“对数死亡阶段”细胞有的开始自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等衰亡期(declinephase)不是所有细胞均处于完全相同的生理状态，因此，在细菌生长的整个周期，细菌数和培养时间，往往是一条缓慢上升以后又逐渐下降的曲线认识和掌握细菌生长曲线，对发酵生产的指导意义：计算生长速率和代时不同生长期的细胞在结构和生理上有很大差别，了解生长曲线，就能根据需要进取样和收获不同的生长期理化因子对微生物的影响可能不同。对数生长期的细胞较为一致，因此常用于研究细胞的新陈代谢在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的(Continuousculture）连续培养控制连续培养方法恒浊连续培养不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定恒化连续培养保持恒定的流速以保持恒定生长速度和养料成分（一）恒浊连续培养用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业连续发酵与单批发酵相比的优点缩短发酵周期，提高设备利用率便于自动控制降低动力消耗及体力劳动强度产品质量较稳定缺点：杂菌污染和菌种退化不断调节流速而使细菌培养物浊度保持恒定的连续培养叫恒浊连续培养由光电装置检测培养容器中的浊度，根据浊度变化控制新鲜培养液流入和旧培养物流出速度，使容器内菌液浓度恒定工业发酵中用此法可获得大量菌体及代谢产物恒浊连续培养（二）恒化连续培养使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。恒化培养控制恒定流速，使由于细菌生长而耗去的营养物及时得到补充，又叫恒组成连续培养。这样，细菌的生长速率将取决于限制性因子的浓度。多用于科研遗传学：突变株分离生理学：不同条件下的代谢变化生态学：模拟自然营养条件建立实验模型同步培养在分批培养中，各个细胞的生理状态、代谢活动并不完全一样。如果以群体测定结果的平均值来代表单个细胞的生长或生理特性是不符合客观实际的，然而利用单个细胞进行研究又是很困难的。为了解决这一问题，就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，因而发展了单细胞的同步培养技术同步培养法synchronousculture能使培养的微生物处于比较一致的生长发育阶段上的培养方法利用代谢抑制剂阻碍DNA合成相当一段时间，然后再解除其抑制，也可达到同步化的目的。试验证明：氨甲蝶呤、5-氟脱氧尿苷、羟基尿素、胸腺苷、脱氧腺苷和脱氧鸟苷等，对细胞DNA合成的同步化均有作用。解除抑制法同步生长的时间，因菌种和条件而变化，由于同步群体的个体差异，同步生长不能无限地维持，往往会逐渐破坏，最多能维持2~3个世代，又逐渐转变为随机生长，即非同步化。第三节真菌的生长一、菌丝的生长繁殖菌丝的生长是顶端生长，菌丝各个部分都有极性之分，即位于前端的为幼龄菌丝，位于后面的为老龄菌丝。菌丝生长与营养有关，营养丰富则分支点与菌丝生长顶端的距离短，即分支多而频繁；营养贫乏分支点同菌丝生长顶端距离长，即分支少。菌丝在固体培养基或在液体培养中静止培养时形成菌落，在液体培养中振荡培养时则形成菌丝球。二、孢子生长繁殖无性孢子繁殖孢子肿胀（外源肿胀，不需营养；内源肿胀，需要营养）萌发管形成菌丝生长有性孢子繁殖第一阶段是质配（plasmogamy）第二阶段为核配（karyogamy）第三阶段是减数分裂（meiosis）三、真菌在培养基中的生长以菌丝重量为考察指标具有与细菌相似