限制性内切酶酶切位点及保护碱基

寡核苷酸近末端位点的酶切(CleavageClosetotheEndofDNAFragments(oligonucleotides))为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mMTris-HCl(pH7.6),10mMMgCl2,5mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。酶寡核苷酸序列链长切割率%2hr20hrAccIGGTCGACCCGGTCGACCGCCGGTCGACCGG81012000000AflIIICACATGTGCCACATGTGGCCCACATGTGGG810120909009090AscIGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA81012909090909090AvaICCCCGGGGCCCCCGGGGGTCCCCCGGGGGA81012509090909090BamHICGGATCCGCGGGATCCCGCGCGGATCCGCG81012109090259090BglIICAGATCTGGAAGATCTTCGGAAGATCTTCC810120752509090BssHIIGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA8101200500090BstEIIGGGT(A/T)ACCC9010BstXIAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT2224270252505090ClaICATCGATGGATCGATCCCATCGATGGCCCATCGATGGG881012009050009050EcoRIGGAATTCCCGGAATTCCGCCGGAATTCCGG81012909090909090HaeIIIGGGGCCCCAGCGGCCGCTTTGCGGCCGCAA81012909090909090HindIIICAAGCTTGCCAAGCTTGGCCCAAGCTTGGG8101200100075KpnIGGGTACCCGGGGTACCCCCGGGGTACCCCG810120909009090MluIGACGCGTCCGACGCGTCG810025050NcoICCCATGGGCATGCCATGGCATG814050075NdeICCATATGGCCCATATGGGCGCCATATGGCGGGGTTTCATATGAAACCCGGAATTCCATATGGAATTCCGGGAATTCCATATGGAATTCCC810121820220000757500009090NheIGGCTAGCCCGGCTAGCCGCTAGCTAGCTAG810120101002550NotITTGCGGCCGCAAATTTGCGGCCGCTTTAAAATATGCGGCCGCTATAAAATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATAAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA1216202428010102525010109090NsiITGCATGCATGCACCAATGCATTGGTTCTGCAGTT122210909090PacITTAATTAAGTTAATTAACCCTTAATTAAGG8101200002590PmeIGTTTAAACGGTTTAAACCGGGTTTAAACCCAGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG8101224000750255090PstIGCTGCAGCTGCACTGCAGTGCAAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8142224260109090001090900PvuICCGATCGGATCGATCGATTCGCGATCGCGA81012010002510SacICGAGCTCG81010SacIIGCCGCGGCTCCCCGCGGGGA812050090SalIGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGCGCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA2830320101005075ScaIGAGTACTCAAAAGTACTTTT81210752575SmaICCCGGGCCCCGGGGCCCCCGGGGGTCCCCCGGGGGA68101200109010105090SpeIGACTAGTCGGACTAGTCCCGGACTAGTCCGCTAGACTAGTCTAG810121410100090905050SphIGGCATGCCCATGCATGCATGACATGCATGCATGT81214001002550StuIAAGGCCTTGAAGGCCTTCAAAAGGCCTTTT81012909090909090XbaICTCTAGAGGCTCTAGAGCTGCTCTAGAGCACTAGTCTAGACTAG810121409075750909090XhoICCTCGAGGCCCTCGAGGGCCGCTCGAGCGG810120101002575XmaICCCCGGGGCCCCCGGGGGCCCCCCGGGGGGTCCCCCCGGGGGGA810121402550900759090