黄酮的提取-1

生物学综合实验论文题目木芙蓉花中有效成份提取与性能研究作者姓名学号所在院系生命科学学院学科专业名称生物科学导师倪明论文完成时间2013年7月02日2摘要：黄酮类化合物（flavonoids）是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮（flavone）结构的化合物，是一类低分子天然植物成分，又称生物黄酮或植物黄酮，属植物次级代谢产物，广泛存在于各种植物和大型真菌中。到目前为止，已经发现有5000多种植物中含有黄酮类和异黄酮类化合物[1]。近年来，黄酮类化合物作为一种天然药物引起了人们的广泛重视，例如，如芦丁、槲皮素等能够增强心脏收缩[2]；杜鹃素具有止咳祛痰作用；黄芩苷具有抗菌消炎、抑制肿瘤细胞作用；水飞蓟素具有保肝作用等；此外，黄酮类化合物还有降血脂、止血、抑制血小板聚集等多种药理作用。黄酮类化合物在人体不能直接合成，只能从食品中获得。主要是作为食品添加剂或直接应用于食品中增加其保健作用。目前人们积极关注如何从植物中提取纯度高，活性高的黄酮类物质。黄酮类化合物的主要提取方法是有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波提取法、超临界萃取法、酶浸渍萃取法。本文重点介绍了这有机溶剂提取方法，从木芙蓉中提取黄酮并对提取液中总黄酮，多酚，总黄酮对亚硝酸钠清除率，总黄酮对亚硝胺合成阻断率进行了测定。关键字：黄酮，多酚，木芙蓉。3目录1.前言………………………………………………………………………..42材料与方法…………………………………………………………………92.1材料…………………………………………………………………………92.1.1实验材料…………………………………………………...92.1.2仪器设备………………………………………………….102.1.3试剂及溶液……………………………………………….102.2方法……………………………………………………………………………112.2.1样品的处理及提取…………………………………………112.2.2样品的测定…………………………………………………112.2.2.1黄酮类物质的鉴定方法……………………………112.2.2.2黄酮类物质定量测定………………………………122.2.2.3多酚测定……………………………………………132.2.2.4抑制亚硝化反应……………………………………143结果与分析………………………………………………………………..153.1黄酮类物质的鉴定方法……………………………………………153.2黄酮类物质定量测定……………………………………………….163.3多酚测定……………………………………………………………183.4抑制亚硝化反应……………………………………………………194讨论…………………………………………………………………………215参考文献…………………………………………………………………….1641前言。1．1黄酮的结构和功能。黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。是一大类以苯色酮环为基础的酚类化合物。植物中由苯丙氨酸产生的肉桂酰辅酶A，经碳链延长环化生成的查耳酮，再衍生成的各种α-苯基衍生物。OOAB2-苯基色原酮黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。此外，它还常与糖结合成苷。天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，并且由于糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同可以组成各种各样黄酮苷类。组成黄酮苷的糖类包括单糖、双糖、三糖和酰化糖。黄酮苷固体为无定形粉末，其余黄酮类化合物多为结晶性固体。黄酮类化合物不同的颜色为天然色素家族添加了更多色彩。这是由于其母核内形成交叉共轭体系，并通过电子转移、重排，使共轭链延长，因而显现出颜色。黄酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等极性5强的溶剂中；但难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。糖链越长则水溶度越大。黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性。酸性强弱因酚羟基数目、位置而异。黄酮类化合物广泛存在于天然产物中，大多具有明显的抗炎、抗菌、生物抗氧化性、抗衰老、降血脂、治疗心血管疾病等功能。其中有些可用于心血管病的治疗。1.2多酚的来源和功能。植物单宁(Vegetabletannins)，又称植物多酚(PlantPolyphenol)为多羟基苯，如苯二酚、苯三酚等，是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物。在维管植物中的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素，广泛存在于植物的皮、根、叶、果中，含量可达20%。植物单宁是植物的次生代谢产物，属于天然有机化合物。常是植物及微生物中产生的酚类次生代谢产物。具有抗氧化性、抗肿瘤、抗动脉硬化、防冠心病与中风等心脑血管病以及抗菌等多种生理功能，是自然界和人类的“健康卫士”。2l世纪随着抗氧化剂理论及研究工作的深入，以及消费者对食品安全性意识的提高，天然抗氧化剂的应用越来越受到人们的重视，回归大自然已是目前一个大趋势。木芙蓉（HibiscusmutabilisL.）为锦葵科植物，又名拒霜花、木莲、醉芙蓉，为落叶灌木或小乔木。其花大色艳，花色一日三变，在寒凉的深秋傲霜怒放，观赏价值极佳。其花、叶、根富含生化药物成分，是极优良的中药材。中医认为，木芙蓉性平味辛，有清热、凉血、解毒、消肿、排毒之功效，适用于肺热咳嗽、月经过多、白带过多、痈疽肿毒、疔疮、水火烫伤等疾病。《本草纲目》言其“治一切大小痈疽，6肿毒恶疮，消肿，排脓，止痛”。木芙蓉花、叶中含有多酚、黄酮类化合物。1.3实验原理1.3.1测定总黄酮的原理:在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下,黄酮类化合物先与亚硝酸钠发生氧化还原反应，再加硝酸铝络合，最后加氢氧化钠溶液使黄酮类化合物开环，生成2-羟基查耳酮而显红橙色,在510nm波长处有吸收峰且符合定量分析的比尔定律,一般与芦丁标准系列比较定量（它的显色原理发生在黄酮醇类成分邻位无取代的邻二酚羟基部位,不具有邻位无取代邻二酚羟基的黄酮醇类成分加入上述试剂时是不显色的）。1.3.2多酚测定原理:总多酚的测定采用Folin-Ciocalteu法测定总多酚含量，其反应原理为酚类化合物在碱性条件下可以将钨钼酸还原，生成蓝色的化合物，颜色的深浅与酚类化合物含量呈正相关，在波长760nm左右有最大吸收，一般与没食子酸标准系列比较定量。1.3.3总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定亚硝酸钠在弱酸性条件下，与对氨基苯磺酸重氮化，然后再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色化合物，用分光光度计测出该化合物的吸光度，就可知道反应液中亚硝酸钠含量多少。据此可以通过测定相同条7件下亚硝酸钠含量的变化反映总黄酮清除能力的强弱，亚硝酸钠含量少，总黄酮清除能力就强，反之则弱。1.3.4总黄酮对亚硝胺合成阻断率的测定二甲胺与亚硝酸钠在模拟人体胃液的条件下(pH3.0，温度37℃)，可适宜地生成二甲基亚硝胺。当往样品溶液中依次加入二甲胺与亚硝酸钠时，样品溶液优先同亚硝酸钠作用，使得二甲胺不能与亚硝酸钠反应，达到阻止亚硝胺生成的目的。据此可以通过比较相同条件下生成亚硝胺量的多少反映总黄酮阻断能力的强弱，生成亚硝胺量少，总黄酮的阻断能力就强，反之则弱。在紫外灯照射下，二甲基亚硝胺可分解成二甲基仲胺和亚硝酸根，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与1-萘胺偶合生成红色化合物，用分光光度计测出该化合物的吸光度，就可知道上述反应液中亚硝胺含量多少。1.4黄酮类化合物的主要提取方法主要有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波提取法、超临界萃取法、酶浸渍萃取法。1.4.1有机溶剂提取法甲醇和乙醇是最常用的黄酮类化合物提取溶剂，高浓度的醇(如90％左右)适宜于提取苷元，60％左右浓度的乙醇或甲醇水溶液适宜予提取苷类。1.4.2超声波辅助提取法8用超声波法提取黄酮类物质，是目前比较新的方法。超声辅助提取法的原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的溶出，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取。1.4.3微波提取法黄酮类化合物的微波提取方法，是通过浸没在提取液中的微波辐射待提取的样品，使其超微结构特性遭到破坏。由于所用的提取剂是微波较容易穿透的，因而微波可自由地通过提取剂，使化合物自由地流人未被加热的提取剂。微波萃取法更简单，而且具有萃取时间短，成本低，萃取效率高等优点。该法适用面更广，能大大提高提物中黄酮类化合物含量，且溶剂损耗较少。1.4.4超临界萃取法（SCDE）超临界流体萃取是利用超临界流体在临界压力和临界温度附近具有的特殊性能作为溶剂进行萃取的一门科学，最常用的超临界流体为CO2。应用CO2—SPE技术提取分离黄酮类物质，具有萃取速度快，效率高，操作简单等特点，产品中没有残留有机溶剂，与传统的萃取分离工艺相比优势是明显的。此外，超临界CO2萃取易与其它先进技术联用，成为新型而有效的分离分析技术。1.4.5酶浸渍萃取法酶浸渍法是近几年根据黄酮类化合物的特性研究出来的一种新的方法。酶浸渍法是指在黄酮提取过程中，通过加入恰当的酶发生转糖反应和酶解反应而使产品黄酮得率和含量大大提高的新兴技术[15]。传9统的水提取只能提取水溶性黄酮，致使类黄酮得率和含量过低；此时如选用恰当的酶加入，不仅可以将油溶性的类黄酮转化为易溶于水的糖苷类而利于提取，而且还可通过酶反应将植物组织分解，使提取传质阻力减小；另外也可使提取液中的杂质分解去除，从而简化后续分离纯化工序。并且其提取条件温和，有利于黄酮类活性保护，且成本低、安全。结语有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波提取法、超临界萃取法、酶浸渍萃取法，以上介绍的这五种方法是提取黄酮类化合物的主要方法。此外还有高速逆流色谱提取技术、超滤技术、植物细胞膜破碎法、液膜分离法等新型提取技术，都有各自优于传统方法的特点。。超临界萃取法速度快、操作简单，产品无溶剂残留；超声波辅助提取无需加热，对有效成分具有保护作用。在提取某些中草药黄酮类成分时，可以将二者合理地结合利用[18]。由于黄酮类化合物具有降压、降血脂、镇痛、抑制血小板聚集、抗骨质舒松、抗心律失常、抗过敏及抗缺氧等多种药理及保健作用[19]，而且黄酮类化合物在人体不能直接合成，只能从食品中获得，现在科学家们都积极关注从植物体中提取纯度高、活性强的天然黄酮成分。因此，对黄酮类化合物的提取以及测定方法的研究具有广泛的前景。2材料与方法。2.1材料。102.1.1实验材料。木芙蓉花采自湖北师范学院校区木芙蓉花、叶中含有多酚、黄酮类化合物。芦丁（上海展云化工有限公司），芦丁是广泛存在于槐、桑叶、苦荞麦、红松松针、新疆雪莲等药用植物中的黄酮类化合物,具有广泛的生理活性,临床上用于防治脑溢血、高血压等,是合成维脑路通的原料。本实验以芦丁为材料作标准曲线测定木芙蓉叶中黄酮含量。2.1.2实验器材。电子分析天平；粉碎机；数显恒温水浴锅；三用紫外仪；真空泵；分光光度计；电热套；比色管；常用玻璃仪器。2.1.3试剂及溶液：对氨基苯磺酸（分析纯）；柠檬酸（分析纯）；磷酸氢二钠（分析纯）；盐酸萘乙二胺（分析纯）；二甲胺（分析纯）；1-萘胺（分析纯）；钨酸钠（分析纯）；钼酸钠（分析纯）；没食子酸（分析纯）；（分析纯）；乙醇（分析纯）；A1(NO3)3（分析纯）；盐酸（分析纯）；NaOH（分析纯）；浓H2SO4（分析纯）；磷酸（分析纯）。学生自配试剂：1、乙醇溶液：60%、80%乙醇溶液。2、10%A1(NO3)3溶液。3、1%三氯化铝溶液。4、2％FeCl3溶液。5、5%NaNO2溶液。116、4%NaOH溶液；1%NaOH溶液。7、5％的醋酸铅溶液。8、1％KMnO4溶液。9、10%、0.5%Na2CO3溶液。10、pH3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液:4.11mL0.2mol/L磷酸氢二钠与15.89mL0.1mol/L柠檬酸混合即可。11、1mmol/L的二甲胺溶液。12、1%、0.4%对氨基苯磺酸溶液。13、0.1%1-萘胺溶液。14、0.2%盐酸萘乙二胺溶液。2.2实验方法。2.2.1样品的处理及提取。1.处理