薄层色谱法

第八章薄层色谱法（Thin-layerChromatography，TLC）目录一基本原理二操作方法三在药物分析中的应用3薄层色谱法通常指以吸附剂为固定相的一种液相色谱法。即将固定相在玻璃、金属或塑料等光洁的表面上均匀地铺成薄层，试样点在薄层的一端，流动相携带样品往前移动，经过一定时间，可在薄层板上形成互相分离的多个斑点，根据斑点的位置与颜色深度进行分析。一、定义:常用的薄层色谱法以吸附剂为固定相,属于吸附色谱的范畴继柱色谱和纸色谱之后发展起来的方法第一节基本原理4薄层色谱与液相色谱法比较HPLCTLC每次只能分析一个样品在一块板上点上多个样品同时进行分离对样品制备要求高，必须不含可吸留在柱上的杂质，否则柱性能受损用毕一次弃去，可直接用样品的粗提物点样可用检测器种类较少展开后可用多种手段检测特点5薄层色谱特点(1)快速(数十秒~数十分钟)(2)分离效率高(多柱路)(3)灵敏度高(斑点扩散小,比纸色谱高10-100倍)(4)专属性强(5)选择性好(6)操作简便、设备简单6比移值（Rf）Rf=原点至组分点中心的距离/原点至流动前沿的距离组分A的Rf=a/c组分B的Rf=b/c相对比移值，即相对于某一物质x的Rf值，用Rx表示。其定义为：Rx＝组分的Rf值／物质x的Rf值组分A相对于物质B的“相对比移值”RB=a/b二.基本参数7三.TLC固定相（一）对吸附剂的要求有足够大的表面积及足够的吸附力对不同组分的吸附具有较好的选择性不与流动相作用，质量稳定，颗粒均匀8（二）吸附剂的种类常用的薄层层析吸附剂有硅胶、氧化铝、纤维素、聚酰胺等。吸附剂的种类不同，可分离、分析的物质也不尽相同。9（三）吸附剂的选择原则吸附剂的选择：主要决定于样品成分的性质，即它们的溶解性、酸碱性、极性以及是否与吸附剂起化学反应等。弱酸性试样宜选择硅胶、酸性或中性氧化铝；试样无色无荧光，选择添加无机荧光剂的硅胶极性小的试样选择吸附活性强的吸附剂极性大的试样选择活性较弱的吸附剂10四.TLC流动相（一）流动相的选择依据“相似相溶”极性大的组分选用极性大的展开剂分离极性小的组分选择极性小的展开剂分离11（二）流动相的选择方法展开剂的选择一般从常用的溶剂开始，然后根据被分离组分在薄层板上的分离效果，进一步考虑通过改变展开剂的极性或采取混合溶剂来达到满意的分离效果。对于结构差异较小或物质极性接近的难分离组分，采用二元、三元甚至多元溶剂做展开剂效果好。对于具有酸碱性的物质来说，可在展开剂中加入一定量的酸或碱调节pH，以获得满意的分离效果。12第二节操作方法制板点样展开定位与显色结果分析13含义：将吸附剂涂布在支持物上制成一厚度均匀薄层的过程。制板的支持物通常用玻璃板，要求表面光洁、平整无油污，具有一定的机械强度，能经受一定的高温，对所用溶剂和显色剂呈化学惰性。规格：5cm×20cm，10cm×10cm，10cm×20cm，20cm×20cm等。制法：干法、湿法。一、制板14（一）干法制备软板定义：采用干法在吸附剂中不加含粘合剂而制成的薄层板称为软板。操作：吸附剂撒在玻璃板一端玻璃棒两端套上塑料管或胶管玻璃棒从撒有吸附剂的一端向前推动特点：操作简便、快速，但是不牢固、容易吹散、吸附剂容易脱落、展开后不能保存、斑点扩散严重、分离效果较差。15（二）湿法制备硬板定义：在吸附剂中加入粘合剂所制成的薄层板称为硬板。操作：吸附剂与粘合剂按照1:3比例置于研钵中研磨制板自然阴干放烘箱活化使用之前检视161.倾注法：将已调成糊状并去除气泡的吸附剂倾倒在玻璃板上，用玻璃棒均匀摊开，然后轻轻振荡，使薄层均匀即可。172.平铺法：在水平台上放置玻璃平板，将准备好的薄层用玻璃板置于此板上，在玻璃板两边加上玻璃条制成框边，将已调成糊状并去除气泡的吸附剂倒在中间玻璃板，用玻璃棒向一定方向均匀地将吸附剂刮平，最后去掉边玻璃框，逐块将薄层板轻轻振荡均匀。183.机械涂铺法：涂铺器中安装有一盛装吸附剂的槽，当槽移动时，吸附剂便从其出口流出，均匀涂铺在玻璃板上。二、点样1.样品溶剂要求溶剂易挥发，点样斑点不容易扩散。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性有机溶剂，避免使用水作溶剂。2.点样设备毛细管、微量注射器、定量毛细管、微量吸管、自动点样仪、半自动点样仪。3.点样量点样量的多少与展开结果直接相关，过大会造成斑点拖尾，过小会得不到清晰的斑点，常用量为几至几十µg，制备型的分离可以点样到mg量。总之点样量随分离目的而定。4.点样过程确定点样位置吸取点样溶液点样。a.用铅笔在距薄层底边1.5-2.0cm处画一条起始线，在起始线上作好记号作为点样位置，每个位置之间的距离为1.0-1.5cm；b.用点样设备吸取一定量的溶液；c.于点样位置上的吸附剂轻轻接触，点样设备内的溶液就会自动被其吸附，形成直径最好为2-4mm的圆点或宽度为5-10mm的条带，完成一次点样。注意：若需要在同一个位置多次点样，则每点一次，应带溶剂挥干后再点下一次，避免斑点扩散；当一块薄层板上需点几个样品时，点样设备不能混用。三、展开1.展开装置2.展开方式3.展开操作方法4.展开注意事项1.展开装置长方型展开槽直立型展开槽232.展开方式(1)近水平展开：将点样后的薄层板下端浸入展开剂0.5cm，薄层上端垫高使薄层与水平成15-30º的角。(2)上行展开：将点样后的薄层放在盛有展开剂的直立型的展开槽中，展开剂由薄层下端借毛细管作用上升至前沿。(3)多次展开(4)双向展开243.展开操作方法a.根据实际情况选择合适的展开缸b.展开缸预先用展开剂饱和c.将点好样的薄层板放入展开缸的展开剂中d.待薄层板展开至规定距离后，取出薄层板，晾干254.展开注意事项a.原点不能浸入展开剂中b.展开时展开剂蒸汽应达到饱和c.展开缸的密封性要好26四、斑点定位展开完毕后，把薄层从层析缸中取出，用铅笔划出或小针刺出展开剂前缘的位置，随即进行显色，以确定各个斑点的位置、Rf值和显色情况，从而判断试样中含有哪些组分。有色物质经展开后呈现明显的色斑，很易判断。对于无色物质，可根据化合物的性质，用以下方法进行定位。（一）显色定位显色定位是在薄层上使用一种或数种化学试剂与被检出物质反应，生成有颜色的化合物而定位。这种试剂叫显色剂。显色剂一般分为两类，即通用显色剂和专属性显色剂。1.通用显色剂常用的通用显色剂有：香草醛-浓硫酸、高锰酸钾水溶液、碘、硫酸溶液等。香草醛-浓硫酸主要用于高级醇、酚、甾体类及挥发油类物质的检出；高锰酸钾水溶液主要用于不饱和化合物的检出；碘对许多有机化合物都可显色，如含杂原子的生物碱、氨基酸等；硫酸对大多数有机化合物也能显色。2.专属性显色剂指能使某一类或少数几类官能团或化合物显色的试剂。异羟肟酸铁试剂是含内酯结构化合物的专用显色剂；碘化铋钾是生物碱类化合物的专用显色剂；茚三酮是氨基酸的专用显色剂；斐林试剂是还原性糖的专用显色剂。（二）荧光定位在紫外光灯的照射下观察薄层板上有无荧光斑点或暗斑。本身能发出荧光的物质可直接在紫外光灯下观察荧光斑点；本身不能发出荧光的物质可与一定试剂反应生成具有荧光的物质再在紫外光灯下观察。31五、结果分析薄层板上的斑点位置确定之后，可对物质进行定性鉴别、杂质检查和含量测定。32第三节在药物分析中的应用主要用于中药、化学药物、生物制品等的定性鉴别、杂质检查、含量测定。33一、在鉴别方面的应用通常采用对照物比较法进行定性鉴别。在保证各斑点分离度达到标准的前提下，如果样品的Rf与对照物的Rf相同，则可认为该组分与对照物为同一物质。为了结果的准确可靠，应采用多种不同的展开系统进行展开，如果所得到的Rf都与对照品一致，则可认定两者是同一物质。34二、在检查方面的应用杂质检查多为限量检查，无需测定杂质的含量，只要检查药物中的杂质是否超过限量。杂质检查法可采用杂质对照品法、供试品溶液的自身稀释对照法或杂质对照品与供试品溶液的自身稀释对照法并用。351.杂质对照法取浓度已知的杂质对照品溶液和制备好的供试品溶液，分别点于同一薄层板上，经过展开和斑点定位后，观察供试品中所含杂质的斑点。除主斑点外的其他斑点应与相应的对照品溶液或系列浓度对照品溶液的主斑点比较，不得更深。前提是有杂质对照品。362.自身稀释对照法将制备好的供试品溶液按限量要求稀释至一定浓度作为对照溶液，再与供试品溶液分别点于同一薄层板上，展开，定位，供试品溶液中除主斑点外的其他斑点应与自身稀释溶液的主斑点比较，不得更深。可弥补杂质对照品法的缺陷。373.两法并用在同一薄层板上，分别点上供试品溶液、杂质对照品溶液以及供试品的自身稀释对照溶液，展开定位后进行观察。可保证杂质检查的准确性。38三、在含量测定方面的应用（一）目视比较法是一种较粗略的含量测定法。将组分对照品配制成一系列浓度已知的标准溶液，与供试品一起点于同一块薄层板上，经展开定位后，比较供试品中斑点的大小及颜色深浅或荧光强弱于对照品中哪一个最接近，即可求得供试品中组分含量的近似值。39（二）斑点洗脱法将已定位的斑点连同吸附剂一起从薄板上刮下，再用适当的溶剂将斑点中的组分洗脱下来，以比色法、分光光度法等测定含量。由于组分在吸附剂上不能完全被洗脱而导致回收率较低。40（三）薄层扫描法将一定波长的光照射在薄层板上，对供试品中能吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药物的鉴别、检查和含量测定。1.基本原理根据薄层扫描的测定方式，分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法。（1）薄层吸收扫描法展开后的薄层，用一定波长单色光束进行扫描，记录其吸光度的变化，得到扫描曲线。由于薄层板存在明显的散射现象，斑点中物质的浓度与吸收度的关系需用Kubelka-Munk理论及曲线来描述。（2）薄层荧光扫描法化合物本身有荧光或经过适当处理后生成荧光化合物者可测量其荧光强度而进行定量。2.仪器：光源、单色器、薄层板台、检测器、色谱工作站3.测量方法：根据对光测定方式的不同，可分为三种透射法：测量反射光的强度反射法：测量透射光的强度L光源；MC单色器；P薄层板；S斑点；PD光电检测器透射法扫描反射法扫描434.扫描方式线性扫描、锯齿扫描线性扫描：扫描速度快，但斑点性状不规则和浓度不均匀时误差大，主要用于荧光扫描法锯齿扫描：斑点的吸光度积分值比线性扫描大、重现性好，能消除浓度分布差异，适用于形状不规则或分布不均匀的斑点，主要用于吸收扫描法线性扫描锯齿扫描455.波长类型扫描波长：(1)单波长扫描：使用一种波长的光线对薄层进行扫描。(2)双波长扫描：是采用两种不同波长的光束先后扫描所要测定的斑点，并记录下此两波长吸光度之差，可以消除薄层背景吸收的干扰。化合物斑点的吸收光谱单波长与双波长扫描曲线的比较476.定量方法外标法、内标法、回归曲线法外标法：供试品与标准品交叉点在同一块板上，供试品点样不少于4个，每一个浓度对照品不少于2个，调整标准溶液的浓度或供试品与标准溶液的点样量，使其峰面积接近，点样必须准确，宜用定量毛细管点样。48内标法：选用一个物质作为内标物，并准确称取一定量内标物加到供试液及标准液中，计算供试品溶液中某组分含量的定量方法。对于复杂样品，不易找到适宜Rf的纯品内标物，且溶液配制等操作较麻烦，所以实际工作中主要采用外标法。49回归曲线法：将不同浓度的标准溶液与供试液点在同一块薄层板上，展开，扫描，由计算机对所测得的峰面积及相应点样量进行线性或非线性回归，由回归方程或回归曲线计算供试液含量。