国家自然基金申请成功范本2

二、立论依据（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。重症肝炎（又称暴发性肝功能衰竭）发生多与肝炎病毒感染、化学药物中毒等因素有关，我国又是病毒性肝炎发生大国，每年都有相当一部分病人患重症肝炎，每年仅重医大附二院传染科收治的重症肝炎病人就近几十例。重症肝炎以起病急、病情进展快、病死率高为特点，目前对它的发生机制仍未搞清，因此它严重威胁着人们的生命健康。国内现主要以综合疗法治疗重症肝炎，此疗法虽对改善疾病的某些症状有一定帮助，但并未从根本上改变该病的预后。国外多以肝移植来治疗本病，其近期疗效明确而肯定，但远期疗效因受免疫排斥反应的制约而不容乐观。近两年国内几家大医院也相继开展了肝移植手术，但受手术复杂性、器官来源以及接受肝移植者需长期服用免疫抑制剂来避免排斥反应发生所造成的高昂药费和长期使用免疫抑制剂可能造成肾损害等因素的制约，仍限制了此疗法的开展。人和哺乳动物的肝脏具有强大的再生功能，2/3肝切除后的动物在10-15天左右残存肝脏可恢复到术前体积，而重症肝炎患者多表现为缺乏这种再生能力。究其原因除了残存肝细胞不能为机体代谢提供足够的肝功能支持外，激活的免疫细胞及其产生的炎症因子仍不断造成残存肝细胞坏死，甚至杀伤新生肝细胞，从而严重阻碍了肝脏的再生。近年来越来越多的研究证实肝内和浸润的单核巨噬细胞及其产生的炎症因子在造成肝细胞大量坏死、杀伤新生肝细胞方面起了极其重要的作用（1，2）。如果抑制或删除肝内的单核巨噬细胞，或中和炎症因子就能大大改善肝脏的再生能力（3，4，5）。在这些研究中人们多使用相应的单克隆抗体来删除或中和单核巨噬细胞和它们产生的炎症因子。但单克隆抗体多来自小鼠杂交瘤细胞，用于人体治疗受到限制。急性肝功能衰竭时如能提供一定数量的外源性肝细胞和某种能抑制肝内单核巨噬细胞功能的物质，起到既阻止残存肝细胞进一步坏死和杀伤新生肝细胞，又能避免外源性肝细胞遭到排斥，同时还能支撑机体代谢需要，减轻残存肝细胞的负担，使它们有足够时间再生，达到治愈肝功能衰竭的目的。众多的动物实验已证明肝细胞移植加免疫抑制剂可满足这一目的（6，7，8），但免疫抑制剂都是非特异地抑制机体的整个免疫系统，在降低免疫反应的同时也降低了机体的抵抗力，常常引起严重的继发感染，而且免疫抑制剂多有严重的毒副作用，如临床常用的环孢霉素A就有严重的肾毒性，这些在重症肝炎常是导致病人死亡的危险因素。1994年Hagiya从乳鼠肝脏中分离出一种能促进肝脏再生的物质，并克隆了它的cDNA，为它取名为肝再生增强因子（augmenterofliverregeneration，ALR）（9）。我们已从人胎肝组织中克隆出人ALRcDNA，成功构建了它的真、原核重组表达质粒，并进行了高效表达（10，11）。新近的研究发现ALR能通过抑制肝内NK细胞的活性来促进肝细胞再生（12，13）。在胎胰岛细胞移植加ALR治疗糖尿病大鼠的研究中也发现，凡在移植细胞部位加注ALR的大鼠血糖都恢复到正常水平，而单独接受胎胰细胞移植治疗的大鼠无一只血糖恢复正常，说明ALR使移植的胎胰细胞避免了排斥反应，能存活并发挥功能（14）。基于这些最新研究成果，我们拟探讨胎肝细胞移植与ALR联合运用治疗急性肝功能衰竭的可行性及其相关机制，期望为临床治疗重症肝炎找到确实有效，又经济可行的治疗方法；同时探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法；并通过本研究观察在急性肝损伤时血和肝组织中ALR和TNF-α、IL-1等炎症因子的变化关系，进一步阐明ALR的作用机理。本课题如获成功必将为重症肝炎患者带来福音，产生巨大的社会效益及经济效益。1．顾长海，王宇明。急性肝衰竭。成都；四川科学技术出版社，1997；11-212．NikolaLV,LorenzoP,AlessandroA,etal.Changesofliver-residentNKcellsduringliverregenerationinrats.JImmunology1995;154:6324-63383．BlazkaME,ElwellMR,HolladaySD,etal.Histopathologyofacetaminophen-inducedliverchanges:oleofinterleukin1alphaandtumornecrosisfactoralpha.ToxicolPathol1996;24:181-1894．TamuraF,MasuharaA,SakaidaI,etal.FK506promatesliverregenerationbysuppressingnaturalkillercellactivity.JGastroenterolHepatol1998;13:703-7085．BoultonRA,AlisonMR,GoldingM,etal.Augmentationoftheearlyphaseofliverregenerationafter70%partialhepatectomyinratsfollowingselectivekuffercelldepletion.JHepatol1998;29:271-2806．TakeshitaK,IshibashiH,SuzukiM,etal.Hepatocellulartransplantationformetabolicsupportinexperimentalacuteischemicliverfailureinrats.CellTransplant1993;2:319-3247．DemetriouAA,ReisnerA,SanchezJ,etal.Transplantationofmicrocarrier-attachedhepatocytesinto90%partiallyhepatectomizedrats.Hepatology1988;8:1006-10098．MitoM,SusanoM,SawaM,etal.Hepatocytetransplantationforhepaticfailure.TransplantRev1993;7:35-439．MichioHagiya,AntonioFrancavilla,LorenzoPolimeno,etal.Cloningandsequenceanalysisoftherataugmenterofliverregeneration(ALR)gene:ExpressionofbiologicallyactiverecombinantALRanddemonstrationoftissuedistribution.Proc.Natl.Acad.Sci.USA1994;91:8142-814610.中华肝脏病杂志。1999;7(3)11.中华肝脏病杂志2000；8（1）12.FrancavillaA,VujanovicNL,PolimenoL,etal.Theinvivoeffectofhepatotrophicfactorsaugmenterofliverregeneration,hepatocytegrowthfactor,andinsulin-likegrowthfactor-IIonlivernaturalkillercellfunctions.Hepatology1997;25:411-41513.TanigawaK,SakaidaI,MasuharaM,etal.Augmenterofliverregeneration(ALR)maypromoteliverregenerationbyreducingnaturalkiller(NK)cellactivityinhumanliverdiseases.JGastroenterol2000;35:112-11914.AdamsGA,MaestriM,SquiersEC,etal.Augmenterofliverregenerationenhancesthesuccessratsoffetalpancreastransplantationinrodents.Transplantation1998;65:32-36－3－三、研究方案1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题（1）研究目标：通过本研究探讨胎肝细胞移植与ALR联合运用治疗急性肝功能衰竭的可行性及其相关机制，期望为临床治疗重症肝炎找到确实有效，又经济可行的治疗方法。同时探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时通过观察在急性肝损伤时血和肝组织中ALR和TNF-α、IL-1等炎症因子的变化关系来进一步阐明ALR的作用机理。（2）研究内容：a：D-氨基半乳糖制造大鼠急性肝功能衰竭模型；b：Ⅳ型胶原酶灌注消化胎鼠肝脏制备胎肝细胞；c：电转化带有HBV-S基因的重组真核表达质粒pCDNA3.1-S入胎肝细胞；d：ELISA法或免疫组化法检测含pCDNA3.1-S的胎肝细胞体外培养时表达HBsAg的情况；e：比较经不同冻存条件、不同冻存时间处理后，胎肝细胞复苏存活率；f：用ELISA法和免疫组化法检测造模组和正常鼠血及肝组织中的ALR，了解ALR的变化情况；g：用组氨酸亲和层析柱纯化大肠杆菌BL21（DE3）表达的大鼠ALR；h：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间动物存活率的差别；i：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间肝脏生化指标、常规病理变化；j：免疫组化法检测不同治疗组存活动物肝组织内HbsAg的表达及分布，以判断移植细胞的存活情况；k：用ELISA法和Northernblot检测不同处理组动物血中和肝组织内TNF-α、IL-1水平及它们的mRNA表达情况，探讨ALR的作用机理；l：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间肾脏生化指标、常规病理变化。（3）拟解决的关键问题：重症肝炎的高死亡率一直困扰着临床医生，除肝移植外至今仍无有效治疗方法。我们拟通过本研究探明胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭的可行性，希望能为重症肝炎的治疗找到突破性方法。探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时可进一步阐明ALR的作用机理、在急性肝损伤时的变化规律以及明确它在肝脏的细胞来源。－4－2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析（1）研究方法、技术路线、实验方案：D-氨基半乳糖制备胶原酶消化胎鼠肝冻存、复苏大鼠急性肝衰竭模型制备胎肝细胞纯化的大鼠ALR电转化质粒pCDNA3.1-S至胎肝细胞对照组FLC＋CsAFLC＋ALRFLCALR比较各项检测指标如果FLC＋ALR组有效，再与冻存细胞进行治疗比较注：图中FLC为胎肝细胞；CsA为环孢霉素A；ALR为肝再生增强因子。（2）可行性分析：本课题的难点是消化分离胎肝细胞、胎肝细胞的冻存复苏、获取大量纯品ALR和鉴定移植的胎肝细胞存活状况。对于前两项相信通过反复摸索实验条件一定能获得满意结果。由于本课题是我们前一自然科学基金项目的延续。我们已构建了人和大鼠ALR的真、原核重组表达质粒，并成功地将其在真核和原核表达系统中进行了表达，获得了高效表达菌株，只要将表达产物用带镍离子的层析柱分离就可得到大量纯品ALR。我们研究所已构建了一系列含HBV-S基因的重组真核表达质粒，只要将这些表达质粒转入胎肝细胞再用于移植，就能区判定移植细胞的存活情况。此外我们还完成了人和大鼠ALR的多克隆和单克隆抗体的制备，为检测血和肝组织中的ALR提供了检测手段，要完成本课题研究应不成问题。3.本项目的创新之处（1）首次探讨胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝功能衰竭的可行性；（2）首次观察急性肝损伤时血和肝组织内ALR的表达