重叠PCR-(Overlap

重叠PCR(OverlapPCR)的基本原理及其简单运用刘梦鸽谢志能曹志秦朱建勋林福龙2016.06.08重叠延伸PCR技术(genesplicingbyoverlapextensionPCR,简称SOEPCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的一项技术。简介特点：可简单迅速将两个DNA片段连在一起，用于嵌合体基因的构建。可以进行定点突变。可以在两基因片段间加入其他序列——酶切位点或者标签。丰富的PCR的扩增范围，尤其在获得长DNA片段方面，省去常规克隆的繁琐。2目的基因5,5,3,3,解旋、退火延伸第二轮扩增大量目的基因多次次扩增PCR图解运用通过酶切法得到相应的粘性末端，再利用连接酶得到任务：两个基因片段，或者一个基因和启动子、终止子要连接在一起。常用的方法1.没有合适的酶切位点2.酶昂贵，使用少重叠PCR技术迅速、经济、简单易行4不可行几个主要的运用大于10000bp的基因基因A基因B基因A+B目的基因CDS1CDS2CDS3内含子内含子无内含子的编码序列5引物的设计基因1基因2F1引物R2引物R1引物F2引物基因1基因2基因1基因2碱基相同区域，至少20bp基因1基因2PCR怎么样发生反应？PCR扩增PCR扩增6反应机理5’5’5’5’3’3’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’加入酶，buffer等反应液。PCR仪中解链，退火——单链模板结合F1引物R1引物F2引物R2引物无目标产物5’5’3’3’加入F1引物、R2引物5’5’3’3’F1引物R2引物大量扩增目的基因基因A基因B7在定点突变方面的应用GC……AAAGGCATCGACG……TTTCCGTAGCTF1引物F2引物R1引物R2引物碱基同源区域突变碱基突变碱基：可以在引物上换成任何其他碱基。碱基同源区域：保证20bp左右，这样有利于OverlapPCR得到目标序列。GC……AAACG……TTTGC……AAATGCATCGACG……TTTACGTAGCTF1引物R1引物F2引物R2引物GC……AAATGCATCGACG……TTTACGTAGCTOverlapPCR得到突变后的目的基因8上述反应体系中，反应液的加入有两种不同的方式一种是先加入酶，模板（基因A和B）buffer，dNTP，水。经过5个循环得到完整的目的基因。然后入引物，大量扩增目的基因。虽然这样操作繁琐，但是可以得到特异性扩增产物。另外一种是直接一步加入所有需要的反应液。虽然此操作简单省时，但是会出现非特异扩增条带，影响胶回收，产量也会减少。9注意事项1、两基因模板间的重叠部分不能少于20bp，否则退火时模板贴不紧，得不到融合的目的基因。2、四条引物的TM值尽量保持相同或一致，利于引物的灵活使用。3、控制重叠PCR的循环次数比一般PCR少，这样可以减少非特异性条带。4、控制PCR模板的浓度，已经融合模板的比例。一般控制摩尔浓度比为1:1，且质量在20ng左右。10谢谢11OVER-LAPPCR得到完整基因ComponentVolume前1067bp片段1μl(20ng)后1174bp片段1μl(20ng)10×LABuffer5μl2.5mMdNTP4μlLATaq0.5μlPCRgradewater38.5μlTotalreactionvolume50μlCyclingconditionsPre-denaturation:98℃,2min.Denaturation:98℃,30sec.Annealing:60℃,30sec.Extension:72℃,1min.Extension:72℃,5min.Finally:4℃,∞.5cycle加入100μM浓度的F和R引物各0.5μlCyclingconditionsPre-denaturation:98℃,2min.Denaturation:98℃,30sec.Annealing:65℃,30sec.Extension:72℃,2min.Extension:72℃,5min.Finally:4℃,∞.12cycle12Maker目的基因条带2154bp胶回收得浓度：40μg/mL