免疫学实验一抗-二抗的选择与搭配原则和方法

一抗、二抗的选择一抗的选择•1.分析实验应用类型WB（WesternBlot免疫印迹）IHC（immunohistochemistry免疫组织化学）ELISA（enzyme-linkedimmunoadsordentassay酶联免疫吸附试验）•2.样本蛋白的结构性质样本蛋白的结构域全长蛋白、蛋白片段、多肽、细菌、细胞样本的提取和处理过程某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域用含此片段域的免疫原制备出的抗体。用FACS流式检测活细胞的表面蛋白用含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。•3.样本的物种选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy和NCBIBLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。•4.一抗宿主物种的选择•一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应，•例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。•如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大，如对不含IgG的细胞裂解物样本的westernblotting检测，尽管如此，含有血清的组织裂解物和组织培养上清中含有免疫球蛋白，还原变性样本中含IgG，在westernblot检测中则结合出现IgG分子50and25kDa的重链和轻链条带。二抗的选择•1.一抗的种属来源二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，•2.二抗的种属来源一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。•3二抗的偶联标记主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC、Rhodamine、TexasRed、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、金颗粒。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于WesternBlot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记；金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。•4.是否经过血清吸附过的二抗为减少二抗与样本的非特异性结合，可选择经过血清吸附过的二抗如检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果对实验的特异性要求很高，选择经过人血清吸附过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于经过人血清吸附而排除了与人源组织（如IgG等）可能发生非特异性反应的IgG，因此将非特异性结合降低到最低。•5.二抗的类别亚型IgM是体液免疫应答首先产生的Ig。IgA是机体黏膜防御感染的重要因素。IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体，它仅以单体形式存在。大多抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgGIgE是同速发型过敏反应发生有关的Ig。IgD以膜结合形式存在于B细胞，在B细胞分化发育中起重调节有作用•IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。【Anti-IgG还是Anti-IgG,F（ab’）2fragment】在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞等细胞内，通常含有较多的Fc受体，这时候选择二抗时最好选择Anti-IgG,F（ab’）2fragment这样的特异性二抗，这样就消除了由于Fc部分与IgG的非特异性结合。常规的Anti-IgG（H+L）二抗与IgG的重链和轻链都有结合反应，即与IgG的Fc的F（ab’）2片段都能结合；由于IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此Anti-IgG（H+L）与它们都有交叉反应。而Anti-IgG,F（ab’）2fragment经过了IgGFc片段的吸附，因此只与IgG的F（ab’）2片段结合。•针对某一种属的抗体可能会和其他一些种属有交叉反应。牛血清白蛋白和奶粉可能含有与抗牛IgG、抗山羊IgG、抗马IgG、抗绵羊IgG等抗体反应的IgG，因此如果使用它们作为封闭液或抗体稀释液的成分，会增加背景染色和降低抗体的效价。•简单说，如果用的是抗牛IgG、抗山羊IgG、抗马IgG、抗绵羊IgG的二抗，那么封闭过程中就尽量不要用牛血清白蛋白和奶粉，以免交叉反应造成背景染色增加和抗体效价降低。