DNA的复制

第3章DNA复制(DNAReplication)3.1.基本概念遗传物质的分子机制分子生物学的核心Watson&Crick:遗传物质必须能行使两种功能，即自我复制和对细胞的高度特异性的影响遗传物质的基本属性：基因的自我复制基因的突变控制性状的表达DNA复制亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。●复制子●复制体一个DNA复制起点所控制的DNA序列称为复制子，即复制起点。原核生物的复制子通常为一个，而真核生物则为多个。是在复制叉组装的蛋白质复合体，负责DNA的合成。包括DNA聚合酶、引发体、SSB、解旋体等。DNA复制在细胞周期S期E.coli37℃0.5h105bp/minS6-8hsM1hG23-4h哺乳动物细胞22-25h500-5000bp/minG112h•复制机理的复杂性双链DNA单链DNA能量的供求构型的变化超螺旋线状，开环状多种酶类的互作复制体DNA复制起始控制机理知之甚少复制的准确性（修复，校正）研究材料的特殊性（温度敏感型，突变抑制体系）DNA复制速度(E.coli105bp/min，高速解旋112km/h?)缺乏统一的模式(双链DNA,单链DNA,线型DNA….)DNA复制的特点★半保留复制★有一定的复制起始点★需要引物原核生物50-100bp，真核生物10bp★双向复制★半不连续复制3.2.复制起点与方向oriC的分离DNA复制的起点（originofreplication,ori）转化缺乏Ampr基因的E.coli受体菌复制起点的特征J.W.Zyskind克隆到E.colioriC确定其最小区段为245bp，并与沙门氏菌等4种细菌的oriC序列进行比较分析发现；•具有245bp富含AT的区域，该区域是DNA聚合酶结合的位点。oriCRNA聚合酶发动引物大肠杆菌沙门氏菌肠杆菌克雷伯杆菌胡萝卜欧氏杆菌真核生物复制起点的研究是以酵母为基础的富含AT•“呼吸现象”DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生，导致两条DNA链不断解链与聚合，形成瞬间的单泡状结构的过程。在富含AT的区域内尤为明显常温（37℃）即可发生解链•复制起点两侧基因的转导频率高4a4b3c3d2e2f1g1haobcaobdecaobdfgecaobdfh复制起点大多数rDNA位于复制起点两侧•子链DNA延伸方向DNA聚合酶只在DNA新链的3’-OH端反应；OHTCATCACOH3’DNA新链的延伸方向为5’→3’。pppOHC++ppi5’PPP5’PPP聚合反应DNA聚合酶只能把单核苷酸5’磷酸加到上一个核苷酸的3’羟基上，结合成链进化中保留的最经济、最有效的方法如果DNA的延伸方向是3’→5’ATCG+5’pppOH3’GpppOHGATCG5’pppOH3’ATCG+5’pppOH3’GpppOHG5’ppp因能量的需要，DNA的5’端必须带有PPP游离dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNacl的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到DNA的5‘端，而且双链DNA的5’端碱基配对困难需要其他机制以解脱碱基发生错配后的校正……费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗ATCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH3.3.DNA的半保留复制三种复制方式假说全保留复制半保留复制弥散型复制离心离心离心(CsCl密度梯度离心)N15N14DNADNA半保留复制M.MeselsonandF.W.Stahl,Sciences44:675,1958.3.4DNA半不连续复制DNA在冈崎片段复制1kb5‘3‘5‘3‘（半不连续复制）1kb1kb1kbDNA半不连续复制DNA半不连续复制证据•DNA中dump片段dUTP:dTTP=1：300细胞中---A-------T--------G--------C----AUGUdut基因dUTPase少数dUTPDNA中不能有U?---A-------T----突变频率=1/1200！？---A------A------U---------UngaseungU尿嘧啶-N-糖基酶UU变性临时片段~1200bp~冈崎片段●ung–临时片段越长●dut–临时片段越短AADNA半不连续复制先导链，滞后链均有dUMP的掺入冈崎片段在某种意义上为dUMP片段先导链按dUMP片段连续复制后随链按冈崎片段不连续复制(原核生物.1-2kb,真核生物.0.1-0.2kb)3.4.DNA复制的模式•复制的多模式单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向DNA复制的模式●双向复制●单向复制●滚环复制（σ复制）●双向复制E.coli复制的θ模型●单向复制E.coliE1单向复制DNA复制方向RNA引物●滚环复制•DNA复制的引物DNA聚合酶不能发动子链DNA的复制起始!E.coli[利福平s][利福平S]+M13E.coliE.coli[利福平R]M13+单链DNA病毒+复制无M13复制利福平M13利福平有M13复制有M13复制M13利福平利福平是E.coliRNA聚合酶的抑制剂•M13复制子的形成需要RNA聚合酶发动合成一段RNA分子作为引物；•复制启动后，RNA引物已经形成，利福平的抑制无效。总结：第一次证明了RNA引物的存在Dnase降解前DNase降解后DNA/RNA引物冈崎片段引物GTP用[32p]标记，用Dnase酶降解DNA，只留下标记的引物。DNase不能完全降解冈崎片段TunekoOkazakiJ.Mol.Biol.184(1985)p.49P32标记13bp的RNA引物●新起始方式或复制叉式（replicationfork）复制起点(θ模型)→RNA引物→转录激活→前导链→复制叉→滞后链多复制子真核生物(500-5000bp/min)•DNA复制的转录激活RNA聚合酶[利福平S]先导链10bpRNA引物ori.dnaG滞后链引物酶[利福平R]引发酶引发体滞后链DNA的合成pppRNA引物DNA聚合酶IIIpppDNApolymeraseIDNA聚合酶IDNA连接酶•RNApol(RNA聚合酶)[利福平S]•dnaG(引发酶)[利福平R]完成对后随链引物的合成•完成±10bpRNA引物合成后，DNApolII进行DNA链的延伸•DNApolI对RNA引物切除并聚合填补•DNA连接酶将冈崎片段、dUMP片段连接完成对先导链引物的合成实现DNA复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个冈崎片断总结：3.5.DNA复制的酶及蛋白质DNA复制时蛋白质的协同作用TopI,TopII解旋酶单链结合蛋白(SSB)螺旋去稳定蛋白(HDP)DnaB蛋白DnaC蛋白引发酶（dnaG）UngaseDNA聚合酶IIIDNA聚合酶IDNA连接酶引发体复制体进化中形成了灵活的多酶复合体1.解旋酶E.coliC/基因组=4.2×106bp30-40s/每次复制10bp/每圈螺旋84000-105bp/min解旋(8400-10000rpm!高速离心机)能量？复制叉两侧DNA双螺旋解旋的相关酶DNA拓扑异构酶IDNA的单链瞬间断裂缓解高速旋转，引入正向超螺旋，解出应力DNA拓扑异构酶IIDNA的双链瞬间断裂缓解高速解旋时，DNA双链的相互缠绕引入负超，消除复制叉移动时产生的正超DNA解旋酶ATpase活性，解除1氢键／水解2ATP解旋酶单链结合蛋白引发体引发酶DNA聚合酶IIIRNA引物DNA聚合酶I（引发酶和解旋酶）（2）参与DNA复制起始的酶RNA聚合酶合成DNA前导链的RNA引物引发酶合成DNA后随链的RNA引物（dnaG）(冈崎片段)单链结合蛋白结合单链DNA（SSB）阻止DNA复性单链结合蛋白（SSB）功能：（1）防止单链重新配对形成双链DNA；（2）防止被核酸酶降解；（3）为DNA复制、重组和修复提供条件。特点：（1）可以被重复使用；（2）不具备酶的活性，不和ATP结合；（3）主要以四聚体形式发挥作用。DNA聚合酶I103kdDNA聚合酶II90-120kd（3）参与DNA复制延伸的酶DNA聚合酶III130kd包含多个亚基原核生物DNA连接酶75kd（连接DNA链3’-OH末端和另一DNA链的5’-P末端，生成磷酸二酯键，消耗ATP）DNA聚合酶I、II、III比较（原核生物）•PolAPolBPolCIIIIII•5’→3’聚合酶活性有有(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+ppi·16-20dNt/秒2-5dNt/秒250-1000dNt/秒DNA的修复、RNA引物切除DNA修复DNA复制•3’→5’外切核酸酶活性有有(校对功能)•5’→3’外切核酸酶活性无无（切除修复）•持续合成DNA长度3-200Nt10kNt500kNt•酶活较弱弱强（I*15,II*300）DNA聚合酶α合成引物DNA聚合酶β不能持续合成DNADNA聚合酶γ合成线粒体DNA真核生物DNA聚合酶δ持续合成DNA（需要PCNA,*40）DNA聚合酶ε持续合成DNA（3）参与DNA复制延伸的酶真核生物DNA复制的特点●多复制子原核生物.105bp/min真核生物.500-5000bp/min13-900kb/复制●DNA聚合酶α+引发酶(50-60kd)6-9NtRNA引物例：果蝇5000复制子受精后基因组复制/3min●每个复制子在一个细胞周期中只启动一次，启动时间并不一致复制子扩增到50,000（机制尚不清楚）后随链的回环模式引发体解旋酶RNA引物引物酶DNA聚合酶III3.6.DNA复制的过程不同生物DNA复制的具体过程有所不同，但是，所有生物体的DNA复制过程都包括三个阶段：（1）起始（2）延伸（3）终止3.6.1DNA复制的起始1.原核生物DNA复制的起始※复制起点E.coli的oriC长度为245bp，由两类元件组成：（1）13bp重复序列，3次重复（13聚体）；（2）9bp重复序列，4次重复。（9聚体）与解旋酶结合启动DNA复制。※复制引发a.形成初始复合体；b.形成开放复合体；c.形成引发前复合体；d.形成引发体。2.真核生物DNA复制的起始S40DNA复制起始T抗原（具有解旋酶活性）与ori结合后，促进DNA解链。复制引物由宿主细胞DNA聚合酶α合成。酵母DNA复制起始复制起点识别复合物具有ATPase活性，该复合物识别并结合自主复制序列，与细胞分裂周期蛋白6结合，激活其ATPase活性，促进DNA复制进行。自主复制序列3.5.线状DNA的复制及避免5’末端短缩的模式3’-OH?3‘-OH环形DNA复制的后随链线形DNA的后随链但是3‘5‘5‘3‘3’-OH?a)WatsonJ.DT7phage•DirectrepeatintheendoflinearDNA•ConcatermerbetweentwooffspringDNAafterreplication共联体(100dNtterminalredundancy)??concatermer3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OH含RNase切割位点RNaseIIIb)ReplicationoflinearAdnovirus-2DNA35937bppTPCGIR103-162IR;including50bpreplicationoriginrichAT&1thC/GhighconversationpTP;pre-Terminalprotein80kd→TP55kdSSB;S.S.DNAbindingprotein72kdAd2DNApolymerase;140kd复制起始复合体引发复制（不需引物）避免5’-endshortenpTp-Ser-dCMPCG●过程SSB+ATPDNA末端解链TPpTP-Ser+dCTPpTP-Ser-dCMP3‘OHIRIRCGGCGCCGpTP-Ser-dCMPReplacedS.SDNAHairpinPanhandlepTP-Ser-d