基因工程-简答题总结

基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。3、足够多的载体和插入片段是最重要的。4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenowfragment3）T7DNA聚合酶4）T4DNA聚合酶5）修饰过的T7DNA聚合酶6）逆转录酶7）TaqDNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？A、化学法（CaCl2法)转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态细胞）。B、电穿孔转化转化原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。影响转化率的主要影响因素:1）载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高；2）插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低；3）受体细胞的类型及预处理；4）转化方法：电击法高于化学法。5、重组体分子的选择方法主要有哪些？并简单阐述其原理。从总体上看，重组体分子的选择与鉴定方法基本上可以分为如下几个类型：（1）基于载体遗传标记检测法在构建基因工程载体系统时，载体DNA分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。（2）基于克隆DNA序列检测法Southern印迹杂交：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。（3）基于外源基因产物检测法如果目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子。第五章基因的克隆一般方法1、基因的克隆方法主要有哪些？并阐述其克隆原理（至少3种，都是书上找的，自选哈，建议必选DDRT-PCR和SSH，原因请看下题）？1）差减杂交（SH）通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库的方式来进行目的基因分离克隆的。2）抑制性差减杂交（SSH）SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。3）差异显示PCR（DDRT-PCR）利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。4）DNA代表性差异分析（DNARDA）代表性差别分析是通过突变型（驱赶DNA，driverDNA）与野生型（检测DNA，testerDNA）基因组之间的差异来分离和鉴定突变基因的方法。5）扩增限制性片段长度多样性（AFLP）基因组DNA经过限制性内切酶消化后，产生粘性末端。使用人工合成的短的双链接头，该接头一端具有同样的内切酶识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板。接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。[2、简单阐述差异显示PCR克隆基因的原理及其优缺点，有何应用？主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。优点：简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。所需的mRNA量少。各样本mRNA的差异可同时进行比较。扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。缺点：假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。工作量大。无法定量研究。扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。利用该技术，目前已有越来越多的差别表达基因得以分离和鉴定，在分子生物学和基因工程研究领域发挥了极大的作用。（P221）3、抑制性差减杂交的原理与应用。原理：SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。应用：基因突变体的研究：如基因的表达与不表达；基因时空表达的研究：如根、茎、叶；不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。4、酵母双杂交技术、噬菌体表面展示技术的原理。A．酵母双杂交技术原理：大部分真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分隔开的结构域，一个是DNA特异结合域（DNA-bingingdomain,BD），一个是转录激活域(transcriptionalactivationdomain,AD)。这两个结构域各具功能，互不影响，但一个完整的、具有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成其激活功能。不同来源的激活因子的BD区与AD区结合后则能特异地激活BD结合基因的表达。B．噬菌体表面展示技术原理：当外源DNA片段插入丝状噬菌体基因组的一个外被蛋白基因中时，如果两者读码框结构保持一致，这个外源DNA片段所编码的产物可与此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表达，并显示在噬菌体的表面。利用抗此外源基因编码产物（多肽或蛋白）的抗体，通过亲和纯化，就能从大量的噬菌体中富集、分离出含有所要的基因的融合噬菌体。然后，通过基因扩增，得到大量所要的目的基因。5、T-DNA标签法克隆基因的一般技术路线。农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。建立突变体基因组文库及野生型基因组文库.用T-DNA片段做probe筛选突变体文库，获得阳性克隆。用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。第七章克隆基因的表达1、通过比较，分析大肠杆菌表达系统和酵母表达系统各有何优缺点。大肠杆菌表达外源基因的优势：全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架；基因克隆表达系统成熟、完善；繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；被FDA批准为安全的基因工程受体生物。大肠杆菌表达外源基因的劣势：缺乏对真核生物蛋白质的复性功能；缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统；内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；周质内含有种类繁多的内毒素。甲醇酵母表达系统的优点：具有强的受严格调控的AOX1启动子表达蛋白的翻译后的加工和修饰营养要求低，工业化生产成本低可高密度发酵表达蛋白可存在于胞内和胞外酵母表达系统的缺点：酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题（这个找不到，百度的）2、如何提高克隆基因的表达水平？1）、表达载体的优化设计；2）、提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性；3）、密码子偏爱性；4）、表达环境条件的优化。3、克隆基因目的蛋白的表达的形式主要有哪些类型？表达蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白两类，具体包括如下几种结构形态：包涵体型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白5、表达载体和基因工程一般克隆载体在元件构成上有何差别？表达载体：启动子；终止子；核糖体结合位点（SD序列）；筛选标记；复制子（质粒拷贝数）；多克隆位点克隆载体：筛选标记；复制子（质粒拷贝数）；多克隆位点第八章植物基因工程2、外源基因导入植物的方法主要有哪些？物理方法：电击法、基因枪法(biolistic)、显微注射法、微激光束法化学方法：PEG介导法、脂质体介导法生物学方法：农杆菌介导法、花粉管通道法四．问答题（一）简答4．某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因。答：盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。5．在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp的II类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么？答：回文序列是5’-CATATG-3’。6．下面几种序列中你认为哪一个（哪些）最有可能是II类酶的识别序列：GAATCG、AAATTT、GATATC、ACGGCA？为什么？答：GATATC和AAATTT，因为它们是回文序列。7．用Klenow酶填补的办法可使5'黏性末端转变成平末端。这种方法常使DNA上的某些限制酶的识别位点消失。请问，对于下列限制酶，用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失？BamHI(G↓GATCC)、TaqI(T↓CGA)、BssHII(G↓CGCGC)。答：BssHII不会。四、问答题2．DNA连接酶的作用特点有哪些？①连接反应需要在一条DNA链的3’末端具有一个游离的-OH,而另一条DNA链的5’末端具有一个磷酸基团(-P)的情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用，而在末端带有5’-羟基和3’-羟基；5’-磷酸和3’-二脱氧核苷基团的两个DNA片段之间不起连接作用。②连接反应中需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子和激活因子；③DNA连接酶不能够连接两条单链的DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分。④DNA连接酶只封闭双螺旋DNA骨架上的缺口(Nick)，即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的裂口（Gap）。3．影响DNA连接酶连接反应的因素主要有哪些？答：1)反应温度：最佳反应温度37℃，但黏性末端之间退火形成的氢键结合不稳定，连接黏性末端的最佳温度，一般认为4～20℃比较合适。2)DNA片段末端：不仅要考虑反应体系中DNA末端的总浓度，还要考虑载体与插入片段的末端浓度的比例。原则上应保证一个DNA分子的末端有较高的几率与另一DNA分子连接，减少同一个分子两个末端之间的自身连接。载体与插入片段3：1~1：3。3)连接酶浓度：平末端DNA分子的连接反应，最适酶量大约是1～2单位；而黏末端DNA片段间的连接，在同样的条件下，仅为0.1单位时，便能得到最佳连接效率。四、问答题1．YAC载体具有什么样的？为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？答：（1）功能