western-blot-全过程-详细步骤

一：提蛋白：1.PBS洗2遍，加RIPA80-100ul（含10xcooktail）。2.在冰上刮到离心管中，在冰上裂解20-30min。3.4度离心，13000rpm、10-15min（准备新的离心管、配BCA200ul/每孔(A:B=50：1)、96孔板加PBS(2个对照组20ul，实验组18ul)）。4.取上清转移到新离心管中，记住转移的体积。5.96孔板中每孔加2ul蛋白液。6.每孔加200ulA/B混合液。7.37度半小时。8.测浓度以及标化用一起在libo文件夹找模板，最后得到每组需要加的RIPA以及lodingbuffer，还有标化后的浓度。562波长0.046斜率（实验组值-对照组值）/斜率=浓度浓度最好在4-8ug/ul最好，跑胶时就可以只加10ul蛋白液（蛋白含量40-80ug）9.加好对应的RIPA以及lodingbuffer后，煮蛋白5-15min，-20度保存。二：跑胶1.1.0玻板，洗干净2.配制10%或者12%分离胶一块胶需要5ml3.灌分离胶，在分离胶上层灌无水乙醇4.配制5%浓缩胶2块胶需要4ml5.待分离胶干后，灌浓缩胶，插梳子6.待胶干后，将胶及玻板一起放入电泳槽，拔梳子，倒入1*runningbuffer（上腔灌满，下腔过电线丝）7.预电泳，100v，10-15min8.加样（蛋白样品及marker）10ul，marker5ul9.60v10-20min，之后100-110v三：转膜1.配transferbuffer，用10*transferbuffer稀释10倍，并加20%甲醇2.transferbuffer浸泡海绵、滤纸3.pvdf膜，甲醇泡1分钟，清水洗2次，泡在transferbuffer里20min4.胶取出，在transferbuffer里泡10min5.黑胶白膜（一层海绵，2层滤纸）6.转膜100v，1—1.5h（黑对黑，冰板，在冰里跑）四：封闭、一抗、二抗1．5%脱脂奶粉（pbst溶）1h37度2.一抗4度12h3.pbst洗膜，3次，每次10min4.二抗（1:5000）1h37度5.pbst洗膜，3次，每次10min6.显影剂A和B各300ulPBST：1000ml’PBS+1mltween5%脱脂奶粉：100mlPBST+5g脱脂奶粉10*runningbuffer：tris30.3g甘氨酸144.1gsds10g加水至1000ml10*transferbuffer：tris30.3g甘氨酸144.1g加水至1000ml1*transferbuffer：100ml10*transferbuffer200ml甲醇加水至1000ml