Cell-Culture-Process-Scale-Up-Section-II-New-Willi

ProcessOptimizationandScaleup---SectionII细胞培养工艺优化与放大II赵伟,产品应用专家,[e-mail]曲妥珠单抗生物仿制药开发及工艺放大Biosimilar定义EMA对生物仿制药的定义EuropeanMedicinesAgency(EMA)27September2012•生物仿制药是一类与专利药（referencemedicine）高度相似的生物类制剂，与化学仿制药不同，不是简单化学结构的完全仿制。•生物仿制药必须具有与专利药相似的功能基团，允许两者之间存在微小的差异，但需要证明差异不影响药物安全性及功效。WHO对生物仿制药的定义WHOTechnicalReportSeriesNo.977,2013•生物仿制药是一类与专利药在质量、安全和功效上相似的治疗性生物制品FDA采纳的对生物仿制药的定义FoodandDrugAdministration（FDA)2015（美国公共健康服务法，PHSAct；生物药价格竞争与创新法，BPCIAct）•生物仿制药是一类与专利药高度相似，但又存在微小差异的生物制品，两者在安全性、纯度和效能上不存在临床差异（PHSAct）。但人工合成的多肽不属于此列（BPCIAct）。生物仿制药充满机遇•生物仿制药参考专利药的使用范围及用量•生物仿制药在专利药专利保护过期后可以获得批准•1995至2017年欧美生物药（Biologics）专利到期情况仿制药则无需负担药物研发的费用；无需经过昂贵的临床试验（II期临床）提供证明其安全性和有效性的数据生物药是在受控条件下发酵和纯化产生的1.插入编码目的蛋白的基因，确定合适的宿主细胞（需要精确的DNA序列和宿主细胞类型）2.建立细胞库(通过反复精细的筛选，建立独一无二的原始细胞库)3.生产蛋白质（复杂的转录和修饰）4.纯化5.分析6.药物成型05/04/2020page5多级步骤多项测试（超过2000项测试）生物（仿制）药工艺开发流程目录单抗仿制药工艺放大基础数据主因素分析放大策略选择与试错工艺放大与质量控制工艺条件的影响不同变温条件下的培养基筛选细胞死亡与凋亡大规模细胞培养后期，维持细胞高活力显得重要而困难。细胞在反应器中易发生凋亡或坏死用基因工程方法导入bcl-2凋亡抑制基因，可以提高细胞密度与目的蛋白产量。流加培养基中三大营养成分葡萄糖：碳源+能源，浓度高易产生乳酸，抑制细胞谷氨酰胺：氮源+能源，耗竭易导致凋亡氨基酸、维生素及其他：必需和非必需氨基酸，胆碱、生长因子和特殊氨基酸，如羟脯氨酸羧基谷氨酸流加时间点与频率、变温工艺研究目录单抗仿制药工艺放大基础数据主因素分析放大策略选择与试错工艺放大与质量控制设计空间转速[rpm]通气[Lpm]泡沫粘度剪切力耗氧、CO2累积minmaxminmax控制参数设计空间定义搅拌n[rpm]•搅拌桨叶尖线速度u[m/s]•单位体积输入功率P/V[W/m3]•剪切力γ[1/s]通气F[L/min]•单位体积通气速率vvm[Lpm/L]•通气线速率vs[m/s]•体积溶氧系数kLa-value[1/h]Page23Biology+ProcessengineeringBioProcessEngineering实例：细胞蛋白药物生产小试实验在10L垂直搅拌罐中进行，获得良好实验结果后拟放大至200L，粘度μ=1.05×10-3Pa*S，密度ρ=1120Kg/m3。小试罐尺寸为：直径D=174mm，搅拌叶轮d=70mm（D/d=2.5），高径比H/D=2.1，液深HL=1.5D，装液量为6L，通气速率1.5vvm，使用3档三叶斜桨搅拌桨叶，转速n=125rpm。现准备在200L反应器（装料60%，各工艺同上）中试验，请设计试验方案，获得200L罐体放大操作参数。请拿出纸笔进行演算，并记录好放大的流程一、按照几何相似原则确定200L罐体尺寸：应为几何相似，H/D=2.1，D/d=2.5，HL/D=1.5，有效装料体积仍取60%，由此可得：VL=0.2m3×60%=π/4×D2×1.5D可得D=46.7cm，H=2.1D=98.07cm，d=D/2.5=18.68cm，HL=1.5D=70.05cm暂定仍使用3档三叶斜桨搅拌桨叶1、核算小罐雷诺数，判断流体流形Re=nd2ρL/μ=(125rpm/60min)×(0.07m)2×(1120Kg/m3)/(1.05×10-3Pa*S)=1.09×104其中Np由搅拌强度及叶轮形式确定，当液体流形为充分湍流时，对六叶直桨涡轮，Np=6.0，对三叶斜桨，Np=4.7二、根据工艺条件与放大策略确定操作参数Pw0=3Npn3ρLd5=3×4.7×(125rpm/60min)3×(1120Kg/m3)×(0.07m)5=2.40×10-4kW由Re=104判断，液体流形为充分湍流当设定为3档搅拌时，反应器不通气时搅拌功率为2、试算大罐体积溶氧系数根据通气速率为1.0vvm，装液体积为6L，计算反应器通气时搅拌功率为：Pwg=2.25×10-3×(Pw02nd3/Q0.08)0.39=2.25×10-3×[(2.40×10-4kW)2×125rpm*(7cm)3/(6000mL/min)0.08]0.39=2.17×10-4.12kWKLa=(2.36+3.3×M)×(Pwg/VL)0.56Vs0.7×n0.7×10-9=(2.36+3.3×3)×(2.17×10-4.12kW/0.006m3)0.56×(37.88cm/min)0.7×(125rpm)0.7×10-9=1.24×10-6Vs=Q/Ar=Q/(π/4×D2)=0.009m3/min/(π/4×(0.174m)2)=37.88cm/min根据通气量Q及反应器截面积Ar，计算通气线速度Vs为：根据福田秀雄关联式获得相应体积溶氧系数KLa计算值：3、检验大罐通气线速度根据维持通气强度vvm不变的条件，计算大罐通气截面线速度为：Vs=Q/Ar=Q/(π/4×D2)=（0.2×60%×1.5）m3/min/(π/4×(0.467m)2)=105cm/min对比小罐通气截面线速度Vs=37.88cm/min，，大罐通气线速度约为小罐2.8倍。经验表明适合气速范围在40至80cm/min之间。故折中取60cm/min，由此可计算出大罐通气速率为：Q=VsAr=Vs(π/4×D2)=（60/100）m/min×(π/4×(0.467m)2)=0.103m3/min通气强度为：0.103/（0.2×60%）=0.858vvm4-1、按照KLa相等原则计算放大罐搅拌速度和功率放大罐的KLa=(2.36+3.3×M)×(Pwg/VL)0.56Vs0.7×n0.7×10-9=(2.36+3.3×3)×(Pwg/0.12m3)0.56×(60cm/min)0.7×n0.7×10-9=7.06×10-7Pwg0.56n0.7根据Kla相等条件得：KLa=1.24×10-6=7.06×10-7Pwg0.56n0.7即Pwg=2.73n-1.25式aPwg=2.25×10-3×(Pw02nd3/Q0.08)0.39=2.25×10-3×[Pw02×n×(18.68cm)3/(103000mL/min)0.08]0.39=0.048Pw00.78n0.39式b另根据经验公式计算大罐通气搅拌功率为：联立式a与式bPwg=2.73n-1.25=0.048Pw00.78n0.39得Pw0=177.79n-2.10kW式c再由非通气搅拌功率计算公式得：Pw0=Npn3ρLd5=4.7×(n/60)3×(1120Kg/m3)×(0.1868m)5=5.54×10-6n3kW式d联立式c和d：n=29.64rpmPw0=0.144kWPwg=0.0397kW4-2、按照P/VL相等原则计算放大罐搅拌速度和功率利用经验公式求解的KLa往往有较大误差，对一些发酵系统并不理想，利用实际测量的KLa值，计算单位体积输入搅拌功率P/VL则更适于真实的非牛顿流体放大根据P/VL相等原则，有n2/n1∝(d1/d2)2/3n2=n1(d1/d2)2/3=125×(70/186.8)2/3=65rpm因此反应器不通气时搅拌功率为：Pw0=3Npn3ρLd5=3×4.7×(65rpm/60min)3×(1120Kg/m3)×(0.1868m)5=4.57kWPwg=2.25×10-3×(Pw02nd3/Q0.08)0.39=2.25×10-3×[4.572×65×(18.68cm)3/(103000mL/min)0.08]0.39=0.8036kW根据经验公式计算大罐通气搅拌功率为：取通气截面线速度60cm/min：KLa=(2.36+3.3×M)×(Pwg/VL)0.56Vs0.7×n0.7×10-9=(2.36+3.3×3)×(0.8036/0.12m3)0.56×(60cm/min)0.7×650.7×10-9=11.607×10-6目录单抗仿制药工艺放大基础数据主因素分析放大策略选择与试错工艺放大与质量控制•需通过可比性研究显示在质量、非临床、临床疗效和临床安全性方面的相似性，重点在于质量相似（受生产过程影响），包括蛋白结构与关键基团的生物活性。安全与疗效相似则包括风险（免疫反应风险）与效益方面的一致。质量评价•生产工艺•鉴定•物化特性•生物活性•免疫化学特性•杂质•特性•分析方法•稳定性临床评价•药效动力学研究（PD)•药代动力学研究（PK)•PD/PK研究•功效研究•等效优劣分析•等效统计分析•安全性评价•免疫原性分析•安全与功效数据延展非临床评价•一般因素•特殊因素•体外实验•体内实验相似性评价非临床通过充分药代动力学（PK）研究确定给药方案通过充分毒理学试验确定药效学（PD）作用和安全特征临床比较药代动力学、安全性和有效性所有实验必须包含免疫原性试验批准后仍须继续检测安全性风险管理36Animalcellcultureinproduction生产中的动物细胞培养nutrients营养物质cellbiomassproductyield产品收率cellviability细胞活性productstability产品稳定性processparameter:工艺参数：temperature温度pHvaluepH值incubationtime孵育时间feeding补料shearstressing剪切应力mixing混合活细胞05/04/2020page27细胞培养环境1、氨：抑制细胞生长2、乳酸：高浓度乳酸抑制细胞生长3、二氧化碳：产生细胞毒性或改变代谢水平葡萄糖和谷氨酰胺代谢•A:谷氨酰胺酶•B:谷氨酸脱氢酶•C:谷氨酸-丙酮酸转移酶•D:苹果酸酶尽量保证90%葡萄糖能进入三羧酸循环，生成水和CO2乳酸代谢能量代谢与产物表达的关系限制培养过程产率的关键因素营养物耗竭葡萄糖谷氨酰胺其他必需的氨基酸、维生素、无机盐、微量元素等共计30种必需的营养成分代谢副产物积累氨（铵离子）乳酸非必需氨基酸CO2其他抑制物BioPATTrace药物蛋白对生产条件敏感05/04/2020page32生产的细微变化影响生物药完整功能05/04/2020page33不同的的糖基化模式可产生不同功效的蛋白亚型。药物蛋白的药效、药代动力学特性取决于三维结构、糖基化程度、亚型及聚集程度。全世界用10年时间才了解生物制剂生产过程中的小差异会导致巨大功效影响生产稳定控制与生物仿制药多样性05/04/2020page34以欧洲重组人促红细胞生成素的质量规范为标准，对来自巴西、韩国、印度等13个国家的31种生物仿制药进行了分析生物仿制药潜在危害举例---单纯红细胞再生障碍（PRCA）Alpha-重组人肾红细胞生成素（Eprex）上市十年后发生PRCA爆发PRCA的爆发可能仅是由生产流程中的细微改变引起Therearefourmainmodesofoperationforabior