临床生化干扰试验批准指引EP7-A

临床生化干扰实验批准指南(EP7-A)广东省中医院检验科徐建华目的为临床生化检验结果中研究、鉴别和确定干扰物质效应提供背景信息、指导和实验程序专门为厂商和临床实验室制订作用对厂商来说，通过EP7程序可以筛选潜在干扰物质，量化干扰效应，证实病人样本中的干扰，确认分析方法对干扰物质的敏感性，评估潜在的风险，并将有意义的干扰声明提供给用户。对于临床实验室来说，通过EP7的调查策略，规定数据收集和分析要求，确认干扰声明，研究明确的干扰物质带来的结果差异，确保分析方法符合临床要求。主要内容干扰相关概念与理论适用范围干扰实验的判断标准干扰分析前的质量保证干扰测定用病人标本评价干扰建立、确认和验证干扰声明调查分析与临床不一致的病人结果术语分析物(Analyte)：实验室测试的物质或者成分干扰物（Interferent)：样本中不同于分析物并能引起测量偏倚的成分干扰：在临床生化中，由于另一成分影响或样本的特性，待测一定浓度的被分析物出现有临床意义的偏倚干扰标准：干扰物所允许的最大结果偏倚干扰敏感度：某一分析方法对来自其他成分或者样本特性的干扰引起误差的敏感性术语干扰声明：一种物质影响分析方法结果效应的陈述干扰筛选：分析系统评价中，利用高浓度样品进行一系列能鉴别有可能发生干扰的物质差异结果//异常结果//假性结果（Discrepantresult//Anomalousresults//Spuriousresults)：一种与临床不一致的结果，或同一标本的另一个不同结果，或与其他方法不同结果，或与已确定的临床诊断不相符的结果术语内源性干扰：样本中的一些生理物质（例如胆红素、血红蛋白），可对另一些物质分析时引起干扰。外源性干扰：一种源自体外的物质（例如，药物或其代谢物，防腐剂，污染物），可对样本中另一物质的分析引起干扰。术语验证（validation）：通过调查及提供客观证据，证实可以满足某期望用途的特定要求。(users’requirementshavebeenmet(e.g.,accuracyrequirementsforpatients’results)确认(verification)：通过调查及提供客观证据,确认满足了特定的要求。(specifiedcriteriahavebeenmet(e.g.,interferencecriteriaorinterferenceclaims)适用范围1.适用大部分析方法和仪器，特殊方法可能需要必要的调整，如分离技术和免疫学分析方法在附录A中被讨论。2.血清、血浆、全血、脑脊液、尿和其它大多数体液等标本类型都可用本指南评估3.适用以下干扰物质：病理情况下的代谢物，如胆红素、脂肪、蛋白质、血红蛋白等；病人治疗期间引入的物质，如药物、肠外营养、血浆代用品、抗凝剂等；病人吸收的物质，如药品滥用、营养补充等；标本准备引入的物质，如抗凝剂、防腐剂等；标本处理过程中引入的污染物，如手霜、滑石粉、促凝剂等；标本自身的基质效应，其理化性质跟理想的新鲜标本不同。适用范围1.干扰对不准确度的影响不准确度（总分析误差）包括不精密度、方法特异性偏倚和样本特异性偏倚（干扰），对干扰物质的敏感性可以引起系统误差和随机误差。基本概念2.分析前效应分析前分析物或者它的浓度的改变通常称为“分析前效应”，这些作用可能会影响实验结果的临床应用，但不能视作“分析干扰”。这些作用：体内药物作用，如使用药物后因生理响应使激素浓度变化标本处理，由于蒸发、溶血或者血清长时间不分离使电解质、蛋白、水含量改变标本收集，如在静脉滴注时（内含分析物）取样基本概念3.绝对干扰与相对干扰干扰作用可看成是绝对的或相对的绝对干扰：一般病人标本中含有某物质，一旦它的存在即会引起干扰。相对干扰：一般病人标本中含有某物质，其含量相对于混合样品中的平均浓度，不同病人样品中含有该物质的浓度变化引起干扰作用的变化，相对干扰作用在临床实验中更有意义。基本概念基本概念相对干扰一些方法可以校正干扰物的平均浓度做补偿，以使病人标本中的干扰效应减小到最低，有代表性的方法包括样品前处理、设置空白对照、标准血清校准和数学校正，当干扰物的浓度大于或者小于病人样本中的平均浓度时将引起误差。基本概念4.干扰机制由于某干扰物的存在以多种方式影响分析过程，主要机制：物理作用干扰物具有的物理性质，使它与分析物一样被检测出来，如颜色、光散射（光吸收）、洗脱位置、电极响应等。干扰物可能会改变标本的物理特性，如表面张力、黏度、浊度、离子强度等，干扰检测结果。基本概念4.干扰机制化学作用干扰物可能会影响酶活力，例如，阻止金属激活剂结合到活性中心上去，氧化必须的巯基等。干扰物也可破坏或阻止反应，例如，破坏试剂或抑止指示反应。干扰物也可改变分析物的形式，例如，形成复合物或沉淀。基本概念4.干扰机制非特异性干扰物可能和分析物以同样的方式参与反应，例如，苦味酸肌酐方法中酮酸干扰，重氮胆红素方法重吲哚酚硫酸盐的干扰。在免疫化学方法中干扰物和抗体发生交叉反应。例如，茶碱方法中咖啡因的干扰。基本概念4.干扰机制水取代作用非水物质（蛋白质、脂质），由于取代了血浆中部分水体积，影响了一些分析物的测定。这些作用考虑或不考虑为干扰作用，取决于要求的结果是以总体积的浓度表示，还是以血浆水的浓度来表示。干扰实验的判断标准为保证客观性，可接受标准必须在评价实验操作之前就确定。建立可接受标准时，必须考虑临床意义和统计学意义两者之间的差别。1.临床可接受标准基于生理变异源于临床经验基于被分析物变异干扰实验的判断标准2.统计学意义在确定一个物质是否存在干扰前，首先确定所得到的结果是否有统计学意义。3.分析物检测浓度干扰应该在两种医学决定浓度被评估，如果在一种浓度上进行测试，要注意有可能漏过在其他分析物浓度水平上有临床意义的干扰。干扰实验的判断标准干扰实验的判断标准4.干扰物检测浓度决定一种物质在“最坏情况”的条件下是否会产生干扰，干扰筛选应该在实验室期望观察到的最高浓度水平的病人样本中进行。5.潜在的干扰物质干扰分析前的质量保证在进行一个干扰实验之前，必须进行：培训和熟悉精密度确认--EP5《临床生化设备性能的精密度评价》准确度确认--EP9《利用病人样本进行方法学比较和偏倚评估》携带污染评价质量控制--C24《内部质量控制实验：原理和定义》标准化防范—M29《实验室工作人员避免职业感染》安全性和废物处置--参照厂商的标签和材料安全数据表（MSDS）干扰测定（Determinationofinterferencecharacteristics)第一种方法：评价潜在的干扰物添加到样本后的干扰效应（干扰筛选）第二种方法：评价个别有代表性的病人结果与高特异性的比较方法的结果偏倚（用病人标本评价干扰）干扰筛选将阳性干扰物加入测定样品中，与不加的对照组比较有无偏移，称为“配对差异”实验。一般最有效的方法是在较高浓度下对系列可能的干扰物作初步筛选，如果临床显著意义，则该物质不是干扰物，无须进一步实验。反之，具有临床显著意义的，应进一步评价以确定干扰物浓度与干扰程度间的关系，这类实验称为“剂量效应”（dose－response）实验实验设计1.测试组和对照组在同一个分析批内完成；2.计算重复测量次数：有临床意义的最小差异值；假设检验水准；重复性（批内精密度）。实验材料1基础标本（Basepool）从几个健康的、没有进行药物治疗的个体获得适当类型（血清、尿等）的新鲜样本，基础样本应能反映样本基质，能反映分析物的特点。合适的冰冻或冻干样本，确认测试材料是否与临床样本相似计算所需样本量测定基础标本中分析物的浓度并用合适的纯物质调整测试管的分析物浓度到医学决定浓度，应避免加入分析物时引入其他物质，推荐的分析物测试浓度见附录B。实验材料2.贮存液获得合适而纯的潜在干扰物，或者该物质最接近体内循环状态的形式选择一种能够充分溶解分析物的溶剂尽可能小地稀释样本基质，最好小于5%。如果溶解度允许，通常配制成浓缩的20倍的贮存溶液有机溶剂需要特殊的对待，氯仿至少要求1：100的稀释倍数，乙醇浓度大于1～2％时能够使抗体变性。3.对照样本用制备贮存液相同体积的溶剂替代测试干扰物，其他要求与测试样本相同。如果对照样本中存在测试物质（比如胆红素），使用合适的分析方法确定它的浓度。如果对照样本中被分析物浓度与基础样本中明显的不相符，考虑溶剂为潜在的干扰物。实验材料重测次数要求重测次数取决于统计学假设水准当有效假设检验不能确定干扰的方向（正的或负的）时使用双侧检验，当有效假设检验包括干扰的方向（正的或负的）时使用单侧检验重测次数要求双侧检验：Z1-/2：100(1－ß)%的置信水平，z1－ß：100（1－ß）％检验效能，s是重复性标准差。dmax是分析物在测试浓度范围内的最大允许干扰。单侧检验：用Z1-代替Z1-/2z百分位值：重测次数要求z百分位值：举例：检测可接受干扰程度为1.5mg/dL的干扰效应，95％（＝0.05）检验水准时，重复性（批内精密度）为1.0mg/dL,计算重复次数：重测次数要求批内标准差（dmax/s）的倍数：95％（＝0.05）检验水准时检测不同的干扰效应所需的重测次数如下：重测次数要求批内标准差（dmax/s）的倍数：举例在1mg/dL肌酐浓度水平，批内重复测定的标准差为0.075mg/dL，实验室认为0.1mg/dL是一个有意义的干扰。需要测定多少次，可能干扰能被检测到？首先，把不精确度表述为批内重复测定的标准差的倍数：0.1mg/dL/0.075mg/dL=1.33。将1.33向前舍入一位为1.3，上表决定重复测定次数，得出在95％（＝0.05）检验水准时，每个对照和测试样品需要重复测定16次。重测次数要求实验程序“配对差异”实验：1)合适的分析物浓度；2)建立有临床意义差别的标准（dmax）；3)确定每个样品所需的重复测量次数；4)准备临床基础标本；5)准备20倍的浓缩贮存液（潜在干扰物），如果使用另外一种浓度）确定，按照步骤6和8稀释（推荐浓度见附表C）;6)用吸管吸取1/20容器体积的浓缩贮存液到容量瓶中，称为测试样品，7)用基础液补足到刻度体积，充分混匀；8)用吸管吸取1/20容器体积的制备贮存液的溶剂到第二个容量瓶，称为对照样品。9)基础液补足体积，充分混匀；10)准备能够被n整除的测试样本和对照样本，重复测定次数n由第三步确定；实验程序11)按交互的顺序分析测试（T）和对照（C）样本；如果检测系统受携带污染影响，增加额外的样本使对照样本免受来自测试样本携带污染的影响。增加的额外对照样品Cx结果应舍弃。12)记录结果，进行数据分析。实验程序数据分析.1计算观察到的干扰效应的“点估计”，即dobs，是测试样本均值和对照样本均值之间的差值。2计算cut-off值ｄc（双侧检验）ｄnull是无效假设规定的值，通常＝0，对于单侧检验，用Z1－取代Z1－/2。3.计算95％置信区间的干扰效应95％置信区间＝数据分析s是测量方法重复性的批内精密度，n是每个样本的重复测量次数，t0.975n-1为t检验数值表中97.5%和n-1的自由度时的值（n30，2.0是t0.975n-1的合理近似值）。结果解释如果点估计dobs值小于或等于cut-off值dc，可以得出某种物质引起的偏倚小于dmax；否则，接受有效假设，说明由该物质引起干扰的假设成立。当解释干扰测试结果时考虑以下情况：由于吸样错误，真实的干扰可能不同于观察到的“点估计”。如果无效假设成立，置信限100（1－）％接受它；如果有效假设检验成立，置信限100（1－ß）％接受它。相反置信限分别为100％和100ß％。如果被检物为非人血清成分检测，可能会引入人造物品的误差测试浓度的随意选择可能不显示干扰结果解释当一种或多种分析物的浓度出现干扰效应，则可通过剂量效应曲线确定不同干扰物浓度干扰程度，干扰物不同浓度可通过最