PCR仪的分类

11聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）的基本原理PCR反应过程与细胞内的DNA复制相似，但PCR的反应体系要简单的多，主要包括DNA靶序列、引物、4种单核苷酸dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。PCR反应过程有以下3个步骤：①变性。将反应体系混合物加热到94℃，维持较短时间（大约15s-30s），使目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。②退火。将反应体系冷却至特定的温度（引物的TM值左右或以下），引物与DNA模板的互补区结合，形成模板引物复合物。③延伸。将反应体系的温度提高到72℃并维持一段时间，引物在耐热聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以4种单核苷酸（dNTP）作为底物合成新的DNA链。以上三步作为一个循环重复的进行，每一循环的产物作为下一循环的模板。如此循环数十次，从而使目的基因得到指数级扩增，达到检测或获取基因的目的。2PCR仪的分类根据DNA扩增的目的和检测的标准可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR，实时荧光定量PCR仪等几类。2.1普通PCR仪一般把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，称之为普通PCR仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。主要是用作简单的，对目的基因退火温度的扩增。主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。2.2梯度PCR仪一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（通常12种温度梯度）的称之为梯度PCR仪。因为被扩增的不同的DNA片段其最适合的退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样既节约时间，也节约经费。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。真正的梯度，是每一排管都有精确的加热控温探头，2009年为止只有美国ABI公司可以做到。其他的都是从两头的热传递来设计控温。2梯度PCR仪多应用于科研、教学机构。2.3原位PCR仪（有些品牌的PCR仪具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能，通过替换模块进行多用途开展实验工作）是用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪。如病原基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。可保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置进行基因扩增。不但可以检测到靶DNA，还能标出靶序列在细胞内的位置。于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有着重大的实用价值。2.4实时荧光定量PCR仪（fluorescencerquantitivepolymerasechainreaction,FQ�PCR)在普通PCR仪设计基础上增加荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统，形成了具有荧光定量PCR功能的仪器。其PCR扩增原理和普通PCR扩增原理相同，在PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统，得出量化的实时结果输出。荧光定量PCR仪有单通道，双通道和多通道之分。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道；有多种荧光标记的时候使用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记和目的基因表达产物，因为一次只能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR，实现一次检测多种目的基因的功能。实时荧光定量PCR仪主要应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业、科研院校等。实时荧光定量PCR仪＋实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。实时荧光定量PCR的优势3荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，实时荧光定量PCR仪主要是用来定量分析和确定基因转录水平的，而普通的PCR仪是做定性分析和扩增基因片段，定量PCR仪可以做普通PCR仪的工作，但是成本太高。样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。三.特点和优势1．特异性强：引物和探针的“双保险”，避免检测的假阳性。2．灵敏度高：分析PCR产物的对数期，自动化仪器收集荧光信号，避免了许多人为因素干扰。3．避免污染：全封闭反应，无须PCR后处理。4．实现定量：运用标准品获得标准曲线，结合Ct值进行准确定量。5．高效低耗：可实现一管多检。6．操作简便：在线式实时监测扩增结果，不必接触有害物质。7．快速：反应时间1.5小时。四．实用意义：1．提高检测效率，缩短检测周期，提高通关速度；2．降低检测成本，提高经济与社会效益。进口RT-PCR仪器优点：一是国产的一般系统软件和硬件不是很匹配，二是国产的售后服务差，三是不是很稳定。国外用的好的是ABI公司的仪器，它具有稳定性好，灵敏度高的优点。FQ�PCR在预防兽医学研究领域的应用自PCR技术问世以来,病原体的检测能够快速、方便的进行。由于PCR技术假阳性率太高,只要有微量病原体存在就可以得到阳性结果,这并不能完全作为诊断依据,只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义。因此对模板准确定量显得特别重要。而应用荧光定量就能快速、准确地得到4结果。基于此,FQ-PCR在预防兽医学研究领域得到越来越广泛的应用。可动态地研究整个病程中潜在病原体的复活或持续，从而能进行疾病的早期诊断、药物疗效观察、病情判断和预后以及遗传病的诊断等一是在细菌病诊断中的应用。众所周知,炭疽杆菌作为人畜共患病的病原,尤其炭疽杆菌的芽胞可作为生物武器的病原,在很多情况下发挥了它巨大的作用。因此需要建立一种特异、快速的检测方法。王梁燕等报道在100L纯化空气中加入炭疽杆菌细胞,用炭疽特异性引物进行FQ�PCR检测,1h内炭疽杆菌的单个细胞就被FQ�PCR检测到,表明FQ�PCR可快速检测空气传播的细菌孢子,为阻止传染病的流行提供了灵活而强有力工具。Bassler等以血红素基因为目标片段建立TaqMan探针FQ�PCR方法检测单核增多性李氏特杆菌,检测敏感度为50CFU,整个实验在3h内完成。空肠弯曲杆菌是人类主要的食源性病原之一,又由于其特殊的生长条件和容易进入不可培养但可存活状态,因此常规细菌培养鉴定结果不一定可靠。国内阳成波等以LightCycler为平台,先后建立一种基于Taqman探针的荧光定量PCR和SYBRgreenI能与双链DNA结合而发出荧光的特性来定量检测空肠弯曲杆菌。结果发现,所有被检测空肠弯曲杆菌均呈阳性,检测限度为5CFU。整个检测过程在60min内完成。说明上述建立的两种检测空肠弯曲杆菌的荧光定量PCR方法为特异、敏感、快速、简便的定量方法。二是在病毒病诊断方面的应用。目前,用此方法对人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、结核杆菌、巨细胞病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原体的检测。FQ�PCR问世后的几年中,积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展和预后之间关系的资料,这些研究资料不断丰富,将形成感染性疾病的临床分子诊断标准。猫细小病毒(FCV)病是猫重要传染病之一,根据Coutts等报道,25%健康猫带毒,这种猫被认为是主要传染源之一。FCV常规诊断方法多采用病毒分离的方法和常规PCR,Chris等应用SYBRgreen作为荧光染料建立一种鉴定FCV的FQ�RT�PCR方法。利用熔点曲线分析区别特异产物、引物二聚体和非特异产物,不需要电泳鉴定。该方法快速、敏感,整个过程在2h内完成。与病毒分离培养方法相比,两种方法的敏感性相近,但与前者需4d时间相比,后者仅需2h。相比较而言,5Taqman探针技术的特异性更强。Takele等基于Taqman技术,设计特异性引物扩增PERV的pog基因片178bp,将目的片段克隆到质粒中,提取质粒并纯化作标准曲线。该方法能检测20-200万个拷贝的DNA和100-100万个拷贝的目的cDNA片段。结果显示,该方法是一种敏感、快速、高通量定性和定量检测来源于人或猪的PERV的方法。CAV是鸡白血病的病原,主要引起鸡的免疫抑制,其致病机理非常复杂。Carri建立了鸡传染性贫血病病毒特异性的Taqman探针技术,采用FQ�PCR(RT�PCR)检测病毒载荷量和病毒的逆转录水平,为阐述复杂的致病机理提供有力证据。三是在寄生虫诊断中的应用。在预防兽医学研究领域中,寄生虫学诊断方法也经历了一系列的演变过程,尤其FQ�PCR方法的出现使寄生虫的诊断在方法学上跃上了一个新的台阶。在寄生虫学中常用的方法是Taqman探针。如在被感染猪和鼠组织、全血、羊水以及脑脊髓液中的弓形虫定量,其检测极限相当于非实时的套式PCR,但准确率大大提高。线虫病是牛羊等反刍动物的一种寄生虫病。GVon等根据毛圆线虫某属ITS2基因序列设计属特异性引物和Taqman探针,克隆目的片段绘制标准曲线,结果表明,该方法能快速、有效定量检测并能区分很多重要的牛、羊消化道虫。James等用ABIprism7700SDS为平台,应用Taqman探针从小牛腹泻粪便中定量检测水源性寄生虫小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)的cp11基因和16srRNA的FQ�PCR方法。此外,还有人从蜱中定量螺旋体(检测下限小于10个螺旋体),从媒介或宿主中定量和立克次氏体。四是在其他方面的应用。由于FQ�PCR技术具有快速、敏感、不需后续电泳步骤、不易污染检测环境,目前已开始在动物检疫领域显示出明显的优势。如目前进出口禽类和美国、香港活鸟零售市场禽流感的快速检测。其次,用于动物源性饲料、食品或其它日用品中牛羊源性成分的定量检测。目前,疯牛病、绵羊痒病已被证实与人的克雅氏病有直接关系。因此,国际上严格禁用肉骨粉做所有牲畜的饲料用途,动物源性食品、某些日用消费品的安全性也受到关注。6从国内外看不同种类的PCR仪价格差别主要分普通PCR仪、梯度PCR仪和荧光定量PCR仪，不同种类的PCR仪价格差别也很大。ABI美国应用生物公司：老牌的生物公司贵族，ABI在中国有自己的办事处和销售人员。由于ABI是生物仪器的著名品牌，同时在产品推广方面有独到之处，所以其产品的销路一直很好。一般ABI普通的PCR仪（2720）价格大概在48000元左右，而9700型PCR仪价格大约在78000元左右。而梯度PCR仪做得不错的美国Labnet的MultiGeneGradientThermalCycler价格一般在65000上下。ROCHE罗氏诊断：单一产品LightCycler，有三个型号，以科研定位为主。Roche的Lightcycler刚推出的时候确实让人眼前一亮！现在Lightcycler2.0拥有令人心动的优点－－－－-1.快速；2.控温准确；3.多波长检测。此外动态检测范围达10个数量级，而无须将样品稀释；具有熔点曲线分析功能，具有多种检测模式；探针及引物设计方便，杂交探针及引物设计的限制少，而且亦可方便地选用合适大小的扩增（100-1000bp）。其设计另类，是最有特色的PCR仪，当然它的价格也不菲，大约在90000美元左右。而且Lightcycler需要使用特定的毛细管作为样品管，这在某种程度上提高了消耗成本，也不方便作为常规PCR仪使用。罗氏其很多产品如诊断试剂，都进入医院，与医院的关系密切，在国内很多医院使用，市场做得很不错。MJResearch：实时荧光PCR仪刚进入中国不久，孔间能使用不同温度是其特色，现已被Bio-rad收购。Bio-rad伯乐：iCycler是其主打，进入中国已经比较久了，产品和5700一样，是扩增仪上加装定量模块而成，特点是价格较低。最普通的个人PCR仪最低价格曾出现过36800元。另外，美国Cepheid的SmartCycle，在美国定量PCR这领域快和ABI平