蛋白质糖基化的研究及进展

蛋白质糖基化的研究及进展1概述1988年，牛津大学的RaymondDwek在AnnualReviewofBiochemistry上发表题为“糖生物学”的综述，标志糖生物学这一前沿领域的诞生。美国的新罕布什大学首先开展了“糖组学”（glycomics)的研究美国于2001年正式启动了“功能糖组学”的研究“功能糖组学”研究目标基因组计划提供了基本的遗传信息，而许多基因的功能仍需要阐明。其中的关键就是蛋白质的翻译后修饰，而糖基化是最主要的翻译后修饰之一。阐明由蛋白质-糖链所介导的细胞通讯机制糖组学研究的重心便是蛋白质糖基化的研究。蛋白质糖基化研究的基本目标是：寻找编码糖蛋白的基因寻找糖基化位点解析糖链及糖基化肽段的结构研究糖基化的功能基因组信息糖基化位点信息结构信息功能信息现代分子生物学的中心法则：蛋白质的糖基化在生物体是广泛存在的。真核细胞中，有一半以上的蛋白质被糖基化糖链的多样性和复杂性“连接方式异构体”“分枝形成”2蛋白质糖基化的分类1．O-糖基化:糖链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser或Thr等侧链的羟基处2．N-糖基化:糖链连接在蛋白质的Asn的氨基侧链处3．GPI-Anchor糖基化:蛋白质通过肽链的C端共价连接的糖基磷脂酸肌醇锚定在膜脂上。3蛋白质糖基化常用研究方法因为糖链的复杂性，很难通过单一的方法进行序列测定等研究，需要多种方法组合完成。糖基化位点分析糖基化蛋白分析糖链分析糖蛋白糖链释放单糖分析蛋白酶水解去糖基蛋白氨基酸分析糖链糖基肽肽链糖链释放氨基酸序列分析去糖基肽链糖链分馏/纯化结构分析酶解糖基肽/寡糖多糖图谱质谱核磁共振蛋白质糖基化的研究策略1.凝胶技术与质谱联用2.非凝胶技术与质谱联用3.O-β-GlcNAc糖基化研究细胞组织双向电泳切割酶切质谱分析糖链鉴定数据库搜索靶蛋白鉴定及功能分析与磷酸化之间存在“阴阳”关系可以被筛选和鉴定O-β-GlcNApr亲和层析母离子扫描366数据库搜索鉴定4糖基化蛋白质的分离技术蛋白质混合物分离纯化糖蛋白糖肽凝集素ConA是一种典型的对于一系列高甘露糖型的N-连接糖链具有高亲和性的植物凝集素，同时也能结合复杂型的N-连接糖链及双分枝的复杂型的N-连接糖链Mana1-6(Mana1-3)Manβ较强Mana1-2Mana1-6(Mana1-3)Manβ最强缺少三甘露糖核心结构或含有阻碍性的3-OH，6-OH取代基团的Mana（α1-6）较弱GalectinLEC-6PNA半乳糖苷结合凝集素是一类分布广泛，不依赖于金属离子的可溶性凝集素很多生物具有保守性倾向于结合包含半乳糖且具有分枝结构的N-连接糖链花生凝集素是组织化学中用于检测T抗原的。T抗原在黏蛋白中广泛存在（如血型糖蛋白A）可广泛结合于存在O-连接糖链的T抗原上5糖基化蛋白的检测技术1荧光染色检测法丹磺酰肼检测聚丙烯酰胺凝胶中的糖蛋白绿色荧光蛋白即Pro-QEmerald300染色剂SYPRORubbyPro-QEmerald4882与凝集素联用的检测方法蛋白质印迹到膜上后，与标记了地高辛的凝集素一起孵育，再通过与带有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合，最后加入显色试剂进行检测。6质谱在蛋白质糖基化研究中的应用1位点分析a特征离子检测寻找糖基特征离子，进而确定糖肽如NacGlc特征离子为m/z204b酶处理前后酶解肽谱比对在TIC图上，酶解前的糖肽峰酶解后消失，出现去糖肽，根据去糖肽的相对分子量及MS/MS图确定糖基化位点2糖链组成，连接顺序及连接方式的分析ESI串联质谱可以MS和MS/MS谱图进行解析离子肼和FTICR在分析糖链结构方面有其独特优势Cancilla利用碱性降解和MALIDY-FT-MS成功分析了寡糖连接方式质量数推断对于同质量异构的糖基无法分辨（Man/Glu)利用外切糖苷酶处理后，再分析具体的糖链结构还需进行衍生化。（甲基化，还原胺化）增强疏水性和离子化能力Q-TOF-MS高分辨高灵敏度高精确度母离子扫描HexNAc+(m/z204)HexHexNAc+(m/z366)MALDI-TOF-MS能方便的检测出衍生或未衍生的寡糖可以直接分析分子质量较大的糖蛋白，并分辨不均一性展望由于糖蛋白本身的复杂性，蛋白质糖基化的研究必须采取多元化的研究策略和技术，而各种新的检测方法也不断的被采用。随着各种分离技术的不断发展，研究方法也不断翻新。蛋白质糖基化研究也将成为翻译后修饰研究的新热点主要参考文献1夏其昌曾嵘等蛋白质化学与蛋白质组学科学出版社20042HirabayashiJ,etcJCB2002,771(1-2):67-873HirabayashiJ,etcTrendsGlycosciGlyco,2000,20(6):286-2874CourtenayHartetcElectrophoresis2003,24,588–5985CristianI.RuseetcAnal.Chem.2002,74,1658-16646STEVENAetcProteinScience(1993),2,183-196.7BenjaminL.etcAnal.Chem.2002,74,6088-60978WeiLi,etcAnal.Chem.2002,74,5701-57109RongZeng,etcEur.J.Biochem.266,352-358(1999)10PaulineM.etcProteomics2001,1,285–29411SchulzBLetcAnalChem,2002,74:6088-609712RobbeC,etcBiochemJ2004Dec1;384：307-1613Suzuki,etc,AnalChem,2006Apr1;78(7):2239-224314SparbierK，etcJBiomolTech.2005Dec;16(4):407-1315Fukuietc,NatBiotechol,2002,20:1011-1077谢谢