第六章重组体的筛选与鉴定

第六章重组体的筛选与鉴定将目的基因与载体连接形成重组子,然后通过各种方法将重组子导入宿主细胞,得到所需要的带有重组DNA的转化子是基因工程的目的所在.何谓转化子?所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞.为什么对重组子要进行鉴定筛选?在转化反应中,并非所有的细胞中都转入重组DNA分子,即使所有的受体细胞都变为转化体,所获得的转化子仍是多种类型的DNA分子,原因是在连接反应中会有以下几种情况发生:•载体和一个或数个串联目的基因连接•载体发生自连•目的DNA分子发生自连•未发生连接反应的载体和目的DNA片段(更多)为什么对重组子要进行鉴定筛选?因此,在成千上万个转化子中，真正含有期望的重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA的宿主细胞分开，以及将含有正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开，就需要设计出最易于筛选重组子克隆的方案并加以验证。常用的重组子筛选和鉴定方法•重组子大小的鉴定(质粒DNA的快速提取鉴定)•重组子酶切图谱鉴定(限制性核酸酶酶切片段大小鉴定)•DNA序列分析•同源性分析鉴定(原位杂交)•质粒载体的抗性标记筛选•噬菌体包装容量的正性筛选•质粒载体的α互补筛选(蓝白色斑筛选法)•标记补救筛选•翻译产物(Westernblot)•转录产物(Northerblot)•其他方法(报告基因)DNA鉴定载体筛选直接筛选间接筛选重组子的筛选第一节遗传学检测法一、根据载体表型特征的筛选根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是一种比较简单而又十分有效的方法。在基因工程中使用的所有载体分子,都至少含有一个选择标记。质粒常有抗生素抗性基因,如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tetr）、卡那霉素抗性基因（Kanr）根据载体分子所提供的选择性标记进行筛选,是获得重组体DNA分子必不可少的条件之一。在实际操作中,最典型的方法是使用抗药性标记的插入失活作用,或是β-半乳糖苷酶基因的显色反应,将重组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来.而对于λ噬菌体的置换型载体来说,λ噬菌体头部外壳蛋白容纳DNA的能力是有一定限度的。其包装能力应控制在野生型λDNA长度的75%-105%之间（36-51kb），这样才能形成噬菌斑。因此，包装限制这一特性，保证了体外重组所形成的有活性的λ重组体分子，一般都应带有外源DNA的插入片段，噬菌斑的形成本身就是λ重组体的一种筛选特征。由于这些方法都是直接从平板上筛选，所以又称为平板筛选法。一、根据载体表型特征的筛选（一）抗药性标记插入失活筛选法检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。1.以pBR322质粒为例（1）pBR322质粒的一般特性在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别位点。一、根据载体表型特征的筛选（一）抗药性标记插入失活筛选法1.以pBR322质粒为例（2）筛选重组体的原理在Ampr和Tetr这两个基因内的任一插入作用，都会导致Ampr基因或Tetr基因出现功能性失活，于是，所形成的重组质粒都将具有AmpsTetr或Amprtets的表型。当外源DNA片段插入pBR322质粒DNA的BamHⅠ或SalⅠ位点时，抗四环素基因失活（TetrTets），重组体转化子必定具有AmprTets表型。因此，将转化菌先涂布在含有Amp的琼脂平板上，并将存活的Ampr菌落原位影印到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Amp平板上生长，而不在Tet平板上生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA片段的重组质粒转化子克隆.如下图所示同样,在pBR322质粒的Ampr基因序列中,利用PstⅠ限制性核酸内切酶识别位点,插入外源DNA片段,也能应用插入失活作用检测重组质粒,当然,所挑选的菌落就应该是具有AmpsTetr的表型一、根据载体表特征的筛选（一）抗药性标记插入失活筛选法pBR322pBR322pBR322AmprTetrAmprTetrAmprTets+菌落原位影印Amp琼脂平板Tet琼脂平板图应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体一、根据载体表特征的筛选（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法1.乳糖操纵子的结构阻遏蛋白β-半乳糖苷酶β-半乳糖苷透过酶β-半乳糖苷乙酰基转移酶mRNAmRNAlacAlacYlacZlacOPZYAlacIPIRNA聚合酶一、根据载体表特征的筛选（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法2.β-半乳糖苷酶显色反应筛选法原理有许多质粒载体具有β-半乳糖苷酶显色反应的检测功能.应用这些载体系列，当外源DNA插入到它的lacZ基因上时，可造成β-半乳糖苷酶的失活效应，就可通过大肠杆菌转化子菌落在添加X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。一、根据载体表特征的筛选（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法3.举例pUC质粒：带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位点的多克隆位点，但并没有破坏lacZ的阅读框架。大肠杆菌菌株：带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下，pUC质粒和大肠杆菌编码的β-半乳糖苷酶片段都没有活性。一、根据载体表特征的筛选（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法3.举例当质粒转化大肠杆菌后,可形成具有酶活性的蛋白质,它在生色底物X-gal的存在下被IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pUC质粒的多克隆位点上后，则会导致读码框架改变，表达蛋白失活，因此，在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。因此，根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。二、根据插入基因遗传性状的筛选(一)原理重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选.(二)举例当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交放射性自显影杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆。第二节核酸分子杂交检测法一、菌落印迹原位杂交菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的筛选,对于噬菌斑平板,它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。因此，能够进行重复筛选，效率高，可靠性强，而且可以连续使用两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规的检测手段。⑵.核酸分子杂交：①.Southern杂交分析：由英国Southern（1975）发明，将琼脂糖中DNA转移到尼龙膜进行DNA分子杂交分析的方法。筛选基因库得到阳性克隆将限制性酶酶切与Southern杂交结合绘制限制性酶图谱。②.Northern杂交分析：与Sorthern杂交的原理和程序相同。用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，检测mRNA的存在。第三节物理检测法重组质粒的快速提取与酶切鉴定经过遗传筛选得到的阳性克隆还必须进一步进行鉴定，酶切鉴定是最常用的方法之一。通过提取“阳性克隆”的质粒，酶切分析“阳性克隆”中质粒的大小和酶切图谱，通过这种方法鉴定载体中是否含有外源DNA片段，载体中是否含有正确的目的DNA片段。这种方法判断的标准是目的DNA分子和载体的分子大小及酶切图谱。Mr12345678910Mr:DNA分子Marker;1:目的DNA片段;2:目的DNA片段EcoRⅠ酶切;3:空载体EcoRⅠ酶切;4-10:为不同”阳性克隆”质粒的EcoRⅠ酶切分析;从图中可看出:4、5泳道为不含插入片段的空载体；6、9泳道虽然含有外源DNA片段，但因为插入片段的大小和酶切图谱与目的片段不同，所以为假阳性；7、8、10泳道和2泳道的电泳图谱相同（除空载体对应的条带外），所以是阳性克隆。酶切鉴定克隆图此外，还有其他方法，如：Western杂交分析、核酸序列分析、免疫化学检测法等③.Western杂交分析：用于蛋白质的分析。⑶.核酸序列测定：测定克隆后的DNA片段核酸序列。采用Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸终止法测定核酸序列。在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：⑷.核酸序列分析：测定的核酸序列是否为基因、有什么功能，需用计算机软件或生物学实验进一步分析。①.同源序列的分析：同源性比较：将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的同源性，将序列发送到Blast等DNAData数据库进行比较。②无任何同源性的新序列(进行基因功能性研究的方法)将基因导入生物体进行基因失活或过量表达，根据表型推测基因作用；用噬菌体显现（phagedisplay）技术；酵母双杂交系统进行蛋白质的功能分析。①同源序列的分析：阅读框架的分析：一个ORF是一条能编码一条多肽链的DNA序列，具有翻译起始信号和终止信号等。