体内间充质干细胞自我更新、分化及其调控相关组织干细胞的机制研究

项目名称：体内间充质干细胞自我更新、分化及其调控相关组织干细胞的机制研究首席科学家：李保界上海交通大学起止年限：2012.1至2016.8依托部门：上海市科委一、关键科学问题及研究内容拟解决的关键科学问题基于MSC广谱的疾病治疗应用前景，针对目前对MSC的微环境、自我更新、分化机理等缺乏系统研究的现状,本课题拟解决以下关键科学问题:1.通过建立脂肪细胞、成骨细胞、骨髓HSC缺乏及血管再生受阻的动物模型，探讨这几种细胞是否作为骨髓MSC的微环境调节MSC的干性维持、自我更新与分化，寻找这些细胞旁分泌的活性分子在其中的作用，并探讨这些活性分子在抵抗组织衰老、促进组织再生与损伤修复中的作用。2.通过在体研究PTHrP-Bmi1、BMP-MAPK、p16和p53通路等在调控MSC自我更新与分化中的作用机制，阐释MSC自我更新与分化的关键信号分子在抵抗组织衰老，促进组织再生及损伤修复中的作用，并与微环境中的信号分子建立联系。3.通过系统地分析MSC自我更新、分化过程中表观遗传学的改变，寻找受DNA甲基化、组蛋白修饰、non-codingRNA调控的目标基因。结合基因表达图谱，阐释在MSC的维持、自我更新及分化中的新表观遗传学基础。利用基因敲除小鼠，研究若干关键表观遗传调控基因在MSC自我更新与分化中的作用及机制，并研究其与信号通路的关系。4.通过对骨折愈合、HSC造血和神经损伤修复的在体研究，阐释MSC及其分化细胞在这些过程中的作用和机制，以期为MSC的临床应用提供理论依据和指导。探讨两种活性分子通过促进MSC增殖及向成骨细胞分化，加速骨形成和骨折愈合以及促进HSC造血和神经再生与修复的应用前景。主要研究内容1．建立可识别和分离体内骨髓MSC的基因工程小鼠体系拟建立Gt(ROSA)26Sor-YFP；Nestin-Cre小鼠、Gt(ROSA)26Sor-YFP；PrxI-Cre小鼠、Gt(ROSA)26Sor-YFP；Dermo-Cre小鼠，用于观察体内MSC的状况以及通过流式分选这些细胞。2．建立可特异性杀死MSC、成骨细胞或者其他细胞的基因工程小鼠体系利用细胞特异性的CreER(T)和iDTR小鼠，注射白喉毒素特异性杀死Cre表达的细胞。3．MSC的骨髓微环境中的细胞成分和活性分子鉴定特异性地的杀死脂肪细胞/成骨细胞，利用生物活性分子促进HSC从骨髓迁徙到外周血或者抑制血管再生，观察其对MSC增殖和分化的影响；建立并利用细胞共培养体系探讨脂肪细胞、成骨细胞、血管内皮细胞及HSC对MSC的自我更新和分化的影响。利用液体芯片技术分析脂肪细胞、血管内皮细胞、HSC以及成骨细胞所分泌的生长因子及活性分子，并研究它们对体内MSC的调控作用。4．MSC在组织再生与损伤修复中的作用特异性杀死MSC或成骨细胞，比较MSC和成骨细胞作为造血微环境在改善HSC造血中的作用，并探讨BMPRIA和TGF受体特异敲除对HSC造血的影响；研究MSC的减少或缺失对SSRIs（抗抑郁症药物）引起的NSC神经元分化的可能作用；研究MSC的减少或缺失对LPS引起神经损伤修复的影响。5．MSC自我更新与定向分化的信号调控机制研究Bmi1在MSC增殖、分化以及衰老中的作用；研究p53和p16在Bmi1引起的MSC衰老及分化中的作用以及与过氧化物的关系；研究BMP-BMPRIA-MAPK在调节MSC增殖和分化中的作用及分子机理。6．MSC自我更新与分化的表观遗传学调控利用基因敲除小鼠，研究表观遗传关键调控基因在MSC自我更新与分化中的作用及机制；确立在MSC自我更新与分化过程中被表观遗传修饰的靶基因谱以及与上述关键调控基因的关系；搜寻MSC自我更新与分化过程中新的lncRNA和microRNA分子，并阐释其调控成骨分化的功能；建立调控MSC自我更新与分化的表观遗传网络，并与其信号调控网络和基因表达图谱建立联系。7．筛选可调节体内MSC更新、定向分化以及促进组织损伤修复的活性分子改造BMP蛋白分子以及筛选BMPs的小分子激动剂，在体研究BMPs激动剂在体内MSC自我更新、分化、骨再生/骨折愈合以及造血和神经损伤修复中的作用；探讨BMP是否通过MSC或成骨细胞促进造血。二、预期目标总体目标：利用多种动物模型，通过研究正常生理状况下、衰老、骨折愈合、造血、神经损伤修复过程中MSC的活动与功能，在理论方面，阐释MSC的维持、自我更新、分化的调控机制，深入地了解MSC的生物学本质；在应用方面，探讨活性蛋白或小分子化合物通过调节MSC的增殖与分化，在促进骨再生、HSC造血和神经再生修复中的应用，为MSC广泛的临床应用提供坚实的实验依据。最终促使我国在MSC相关领域形成自己的特色，达到国际领先水平。同时，以本项目为纽带，促进多学科、多院校的合作和交流，培养一批优秀的干细胞研究人才。五年预期目标：1．利用本团队已建立的小鼠模型，通过降低骨髓HSC、成骨细胞或者脂肪细胞的数量以及抑制血管再生，研究MSC骨髓微环境中起作用的细胞组成，并利用体外共培养的方法，研究这些细胞分泌的因子对MSC增殖与分化的调控作用以及机制。以骨骼代谢的重要调节分子BMPs入手，阐释BMPs在MSC的维持、自我更新以及衰老中的作用。2．利用Bmi1、p53、p16、p38、Tak1等基因敲除小鼠模型，研究MSC体内自我更新与分化的信号通路调控。揭示MSC自我更新信号的主要调节机制，以及协调MSC分化为成骨或者脂肪细胞的信号调节机制。在此基础上，寻找延迟MSC衰老、抑制MSC脂肪分化、促进其成骨分化的关键信号分子，为延缓骨骼衰老、促进骨再生及损伤修复提供理论基础。3．通过研究分离出的MSC、培养的MSC、以及分化出的成骨细胞、脂肪细胞等的表观遗传学差异，和相应细胞的基因表达图谱进行比较，阐释调控MSC的维持、增殖及分化为不同细胞的表观遗传学机制，寻找在此过程中起重要作用的新调节基因。从而通过控制基因表达延缓MSC衰老，促进其增殖及向成骨分化。4．探讨内源性MSC及其分化的细胞对HSC、神经损伤修复的作用。研究在此过程中正常或者BMP/TGFB信号受阻的MSC和成骨细胞等对HSC微环境的贡献以及对神经损伤修复的作用。改造BMP蛋白分子以及筛选BMPs的小分子激动剂，研究它们对体内MSC的维持、自我更新和分化、以及HSC造血、骨及神经再生与修复中的作用。5．取得具有国际影响的原创性成果,预期在国内外专业期刊上发表一批高水平论文。其中在国际一流学术刊物（IF10）上发表论文10篇以上，在有影响力的杂志（IF5）上发表论文50篇以上。另外，申请专利5项以上。6．预计培养博士后25-35人，博士研究生50-80人及一批学术水平高、创新能力强的中青年学术骨干,为MSC研究打造一支具有国际影响力的高水平研究队伍。三、研究方案学术思路：间充质干细胞作为研究最活跃的成体干细胞，在骨骼的发育与再生中起重要的作用，同时还具有其它干细胞不具有的广阔的应用前景。目前，对MSC的稳态维持、自我更新与分化的调控机制知之甚少，因此无法精细地控制MSC的活动与功能，以达到预期的治疗效果，严重阻碍了MSC的临床应用。此外，人们尚不清楚骨骼以外的修复功能是否也是内源性MSC固有的。在综合本团队及国内外的最新研究进展的基础上，我们将以MSC的微环境、体内自我更新与分化的遗传和表观遗传学机制、MSC支持其它组织（造血和神经）再生与修复的机制为研究主线，以多种基因敲除小鼠为工具，对正常及病理状态下调控MSC命运的关键环节特别是关键分子靶点及信号网络进行系统的研究。通过以上几个方面的系统研究，我们将对MSC的体内自我更新与分化有一个全面的了解，从而指导MSC的临床应用。探讨活性蛋白PTH改变骨髓微环境中的MSC成骨分化促进造血的机制和应用，通过对重组BMP以及BMP小分子激动剂的筛选，寻找可通过调节MSC自我更新与定向分化，对抗骨质疏松、促进骨折愈合以及其它组织修复的小分子药物，提升中国药物研发的能力，创造具有自主知识产权的、具有国际竞争力的新技术、新产品，服务于我国经济发展与人民健康。创新点与特色1.首次利用多种基因工程小鼠（团队拥有几十种基因工程小鼠的资源）对MSC的微环境中各类细胞进行系统的分析；并通过液体芯片技术对这些细胞所分泌的活性生物分子进行系统而全面的分析以及功能验证，对骨髓MSC的微环境提供一个全面的认识。本项目研究的是科学前沿问题、具体目标明确，有很强的创新性。2.利用Prx1-CreER(T)和Dermo-Cre转基因小鼠和iDTR小鼠，在注射小鼠白喉毒素的情况下，特异的杀死体内的MSC，研究内源的MSC在骨折愈合、造血以及神经损伤修复中的作用。该研究对MSC的临床应用具有重要的意义。这有别于以往的MSC的局部注射或者静脉注射，所用的MSC未经过体外扩增，因此可以探讨MSC真正的体内功能。3.率先利用MSC特异性Bmi1或Sirt1高表达，研究它们是否能够通过促进MSC自我更新和向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化而发挥抗骨质疏松作用；率先揭示PTHrP经Bmi1介导抑制p53和p16通路活性，抑制氧化应激反应，刺激BM-MSC自我更新，促进其向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化而发挥抗衰老和抗骨质疏松的作用机制。4.率先研究若干关键表观遗传调控基因在MSC自我更新与分化中的作用及其机制分析；确立在MSC分化过程中被表观遗传修饰的靶基因谱及搜寻新的lncRNA和microRNA分子并阐释其调控成骨分化的功能。5.本项目对贯穿于四个课题的骨形态蛋白进行了较为全面的研究，筛选可以替代BMPs的小分子激动剂，并取得了很大的进展，将为骨质疏松以及骨损伤修复的治疗提供一种新的途径。6.参加人员已在相关领域取得国际认可或领先的前期研究结果。本研究课题所涉及的各个方面内容大多是前期工作基础上的延伸或拓展。因此，本项目具有很高的研究起点和可行性，预期结果必将在国际MSC研究领域中占领新高地，促进我国干细胞研究整体水平和地位的进一步提升。课题设置课题一：成体MSC的骨髓微环境研究目标:1.明确脂肪细胞、成骨细胞、HSC及血管内皮细胞是否作为骨髓MSC的微环境调节MSC的干性维持、自我更新与分化。2.鉴定骨髓MSC微环境的旁分泌活性分子在调节MSC的干性维持、自我更新与分化中的作用。3.明确BMPs是否作为MSC微环境中的重要活性因子。研究内容:1.利用脂肪特异的Adipoq-CreER(T)（Cre和tamoxifen-responsiveestrogenreceptor）；iDTR小鼠（2个月和12个月），注射白喉毒素特异性杀死脂肪细胞，观察脂肪细胞缺乏对Nestin+细胞、PDGFR+及CAR细胞数目及其增殖和分化的影响。2.利用Osx-CreER(T)；iDTR小鼠（2个月和12个月），特异性杀死成骨细胞，观察成骨细胞缺乏对Nestin+细胞、PDGFR+及CAR细胞数目及其增殖和分化的影响。3.利用生物活性分子促进HSC从骨髓迁徙到外周血，观察HSC缺乏对Nestin+细胞、PDGFR+及CAR细胞数目及其增殖和分化的影响。4.利用bevacizumab和carboxyamidotriazole抑制血管再生，观察血管再生损伤对Nestin+细胞、PDGFR+及CAR细胞数目及其增殖和分化的影响。5.建立并利用细胞共培养体系探讨脂肪细胞、成骨细胞、血管内皮细胞及HSC对MSC的自我更新和分化的影响。利用液体芯片技术（Bio-Plex系统）分析脂肪细胞、血管内皮细胞、HSC以及成骨细胞所分泌的生长因子及活性分子，并研究它们对体内MSC的调控作用。6.研究微环境中活性分子在年轻和衰老小鼠的MSC更新与分化中的作用经费比例：30%承担单位：上海交通大学课题负责人：李保界学术骨干：李旌、贾德永、乐黄莺课题二：MSC自我更新与分化的信号调控机制研究目标:1.明确Bmi-1在调节BM-MSC自我更新和分化中的作用及机制。2.明确p53和p16通路在PTHrP和Bmi-1调节BM-MSC自我更新和分化中的作用及机制。3.明确Bmi1是否通过