园艺植物组织培养第8章

第八章离体授粉花的组成与基本结构花花柄Pedicel花托Receptacle花被Perianth雄蕊群Androecium雌蕊群Gynoecium花药Anther花丝Filament子房Ovary花柱Style柱头Stigma8.1.1进行离体授粉的目的克服受精前障碍。8.1离体授粉的方法造成受精障碍的因素：①花粉在柱头上不能萌发；②花粉管不能进人胚珠，造成这种现象的原因或是由于花柱太长，或是由于花粉管生长速度太慢，还没长到花柱基部子房已经脱落；③花粉管在花柱中破裂。克服受精前障碍的方法：蕾期授粉，截断花柱，对花柱进行热处理，辐照处理，混合花粉授粉等。8.1.2离体授粉的含义离体胚珠授粉：将花粉授于离体的胚珠上，进而实现受精作用的方法子房授粉：将花粉粒直接送入子房以实现受精作用的方法。离体授粉:把通过在培养的整个雌蕊的柱头上授粉而结实的方法称为离体授粉。离体授粉包括：离体胎座授粉：把花粉授于连在胎座的胚珠上，进而实现受精作用的方法离体柱头授粉：把花粉授于离体子房的柱头上，进而实现受精作用的方法试管受精：离体的卵细胞和自由游动的精子在体外的融合。离体授粉的应用：克服自交不亲和克服杂交不亲和通过孤雌生殖产生单倍体8.1.3离体授粉的方法子房授粉的方法：由开裂的花药中采集花粉，将之悬浮于含有100mg/L硼酸的无菌重蒸馏水中，密度为每滴悬浮液100-300个花粉粒。在开花之前2d，将用做母本的花去雄套袋。开花以后，将子房用酒精棉进行表面消毒。在子房两侧彼此相对的位置上钻2个小孔，用注射器由1个小孔向子房内注入花粉悬浮液，子房内的空气则由另1个小孔排出。悬浮液要注满子房腔，直到开始由另一小孔中流出为止。注射完毕以后，将2个小孔用凡士林封闭。也可通过一个小缝送人花粉，这可能比通过小孔注人花粉悬浮液的效果更好。注意：在去雄时只摘除雄蕊，若把花萼和花冠同时去掉则会使子房枯萎。离体授粉的方法：①确定开花、花药开裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精作用的时间；②去雄后将花蕾套袋隔离；为了避免意外授粉，用做母本的花蕾必须在开花之前去雄并套上纸袋。③采集花粉粒。为了在无菌条件下采集花粉，把尚未开裂的花药从花蕾中夹出，置于无菌培养皿中直到花药开裂。若要从已开放的花中摘取花药，须将花药进行表面消毒，然后把它们置于无菌培养皿中已灭过菌的滤纸上，直到开裂。④柱头、胎座或胚珠的处理无菌条件下剥取胚珠开花之后1～2d，将花蕾取下，拿入实验室准备进行无菌培养。将花萼和花瓣去掉，把雌蕊在70％酒精中漂洗数秒，以适当的杀菌剂进行表面消毒，最后用无菌蒸馏水彻底洗净，去掉柱头和花柱，剥去子房壁，使胚珠暴露出来。在进行离体柱头授粉的时候，须对雌蕊进行仔细的表面消毒，但不要使消毒液触及柱头。⑤接种一般就是将这个长着胚珠的整个胎座连同一小段花柄用于胎座授粉，或是把胎座切成两半或数块，每块带有若干胚珠，然后以各自的切口和培养基接触，进行培养。单个胚珠接种在培养基把整个子房接种在培养基⑥授粉将散出的花粉在无菌条件下按实验要求授于培养的胚珠、胎座或柱头上。据报道，把花粉授在胚珠或胎座上的效果，比撒在胚珠周围的培养基上效果好。离体授粉方法成败的最重要标志，是在受精之后能否由胚珠（在胚珠和胎座授粉中）或子房（在柱头授粉中）形成有生活力的种子。枣离体授粉及胚珠培养初探郝慧，李登科，金竹萍等材料和方法试验材料取自山西省农业科学院果树研究所国家枣种质资源圃．采用前期试验筛选出的壶瓶枣和晋矮1号两个性状优良的品种分别作为父母本．采集尚未开花的花蕾，将其剪成适合操作的小段(尽量保留零级花)，经常规方法消毒以后用无菌水漂洗3次．用镊子剥去花萼和花冠，取壶瓶枣花粉作父本，晋矮一号去雄作母本，离体子房和花药经活化后进行人工授粉并接种于培养基上，于(25±1)℃光照条件下培养．培养30d后解剖、观察，将成活胚珠取出并转接至胚珠培养基上．部分子房作连续继代培养．不同培养基上子房生长及胚珠成活情况接种的子房在2d～3d后膨大，颜色由绿转黄，但各培养基上的子房生长情况又有所不同．变化最为明显的是5号和7号培养基中的材料，体积膨大明显优于其它培养基，且颜色更为鲜亮。不同培养基中子房的成活率也有差异，其中在7号培养基中最高，为88.9%，5号培养基次之，为84.9%。继代培养的子房保持生长约90d以后不再膨大。接种30d后解剖成活并膨大的子房，这时胚珠大多已褐化、枯死，仅有少量存活．成活胚珠为白色，大而透明，其中，有少数为子房二室三胚珠，未见三个胚珠同时存活情形．子房愈伤组织化与胚珠成活情况：接种以后部分子房愈伤组织化．从剥离出的成活胚珠的比例来看，绝大多数成活胚珠来自愈伤组织化的子房(表3)。胚珠离体培养：将剥出的离体胚珠接种于固体或液体胚珠培养基中．胚珠存活一段时间以后褐化死亡．具体做法是，将柱头、花柱和子房壁组织全部去掉，使胚珠裸露，将花粉粒直接撒于胚珠之上，然后把胚珠置于人工培养基上培养，直到种子成熟。落到胚珠表面上的花粉粒10～15min后萌发，授粉后1～2d内完成受精，5d内受精胚珠膨大，鼓胀而不透明，里面已形成了一个4个细胞的原胚和若干胚乳游离核。22d后，具有两片子叶的胚即已分化完全。罂粟的离体胚珠授粉8.2胚珠和子房培养8.2.1胚珠培养胚珠培养是植物组织培养的一个重要方面，该项技术最初尝试于20世纪30年代，并在兰科植物获得成功，20世纪5O年代以后不断得以完善并取得重要突破。在观赏园艺、蔬菜以及果树等方面均有人进行这方面的研究工作，迄今已在葡萄、桃、李、洋葱、番茄、多花水仙等多种园艺植物上取得成功。利用胚珠离体培养可以克服远缘杂交育种中的胚早期败育障碍，以及胚珠试管受精克服远缘杂交不亲合性。黄瓜受精胚珠离体培养的研究供试黄瓜品种为津杂二号，87-3，87-6，87-9。人工授粉后分别取4-16日龄的子房为外植体，用自来水冲洗干净，分别用7O％乙醇消毒3O秒，0.1％HgCl2灭菌1O分钟，最后无菌水冲洗四次。将子房切成内含胚珠的薄片，接种于预培养基上(MS+蔗糖10%+琼脂0.8%)。约15天左右外植体表面发白，胚珠凸起，取出胚珠移到1／2MS+蔗糖2％+琼脂0.8%的诱导培养基上。培养2O天即生成胚珠试管苗，然后转移到生根壮苗培养基上(MS+蔗糖3%+琼脂0.8%)。一般经过20天左右胚珠苗就可生成为具有正常根、茎、叶的健壮小植株。生长健壮的试管苗经过2天炼苗后分别采用普通移栽法、试管外生根移栽法和T8培养基生根移栽法进行移栽，观察成活率。培养室温度25℃-27℃。预培养和诱导培养阶段每日光照16小时，生根壮苗阶段每日12小时，光照强度均为3000lx。Maheshwari等曾由罂粟授粉后6d的离体胚珠中，获得了有生活力的种子，培养时在这些胚珠中含有的只是合子或2个细胞的原胚及少数胚乳核。在一种只含有Nitsch(1951）培养基的无机盐，White(1943）培养基的维生素、5％蔗糖，而没有任何生长调节物质的相当简单的培养基上，这些胚的生长速度起初虽比在活体条件下慢，但长到球形期以后，生长非常迅速。授粉后26d，这些在培养的胚珠中的胚已长到0.93mm，而同期在活体中的胚最大长度也只有0.65mm。在葱莲属植物中，情况与罂粟属植物和兰花不同，当把含有一个合子和初生胚乳核的胚珠置于Nitsch培养基上培养时，胚虽能长到球形期，但不能分化。即使在培养基中添加了生长调节物质，如激动素、IAA或GA3，也不能促进胚的进一步生长。然而，若在培养基中加入椰子汁或水解酪蛋白，胚即能正常发育，种子能在原位萌发。组氨酸、精氨酸和亮氨酸能完全取代水解酪蛋白的这种促进作用。在培养基中添加激动素或水解酪蛋白能加速这些胚在初期阶段的生长。在白车轴草（Trifoliumrepens）中，只有在培养基中添加了黄瓜或西瓜幼果（开花后10d）的果汁时，授粉1～2d后处在合子期或双细胞原胚期的胚珠，在培养中才能发育成成熟种子。若加人黄瓜汁后再加GA3(10mg/L)，则能进一步促进这些非常幼嫩的胚珠发育成种子。在离体胚株的发育中，培养基的滲透压起着重要的作用，特别是对非常幼嫩的胚珠，其作用格外重要。在矮牵牛中，授粉后7d的胚株处于胚期，若把它们剥离下来，置于含有蔗糖的培养基上培养（蔗糖浓度在4％～10%的范围内高低皆可），它们即能发育为成熟种子。若胚珠内含有的是合子和少数胚乳核，最适的蔗糖浓度为6％；若紧在受精之后，则为8％。培养基的滲透压Pontovich和Sveshnikova(1966)观察到，在罂粟离体胚珠（含有合子或双细胞原胚）培养中，即使培养基里补加了水解酪蛋白、椰子汁、腺嘌呤或激动素，胚仍不能进行分化。然而，若是培养连在胎座上的胚珠，合子就能发育成一个正常分化的胚。这就是在离体培养中胎座组织对胚珠生长和发育的有益影响。胎座具有类似的促进种子发育的作用有些杂种胚在发育早期即可能夭折，要想在此之前把它们剥离下来进行培养，或很麻烦或不可能。在这种情况下，胚珠培养对于获得杂种就有很大的潜在价值。在树棉（Gossypiumarboreum）×陆地棉（G.hirsutuin）杂交中，杂种胚只能发育到授粉后8～10d为止，以后则出现大量的异常现象，使胚不能进一步发育。Beasley(1940)和Weaver(1958)把它们的未成熟胚进行培养，以期获得完整的植株，但离体胚没能生长。Pundir(1967)在授粉后3d(胚珠内含有合子或三细胞原胚)，把胚珠剥离下来，放在含有50mg/L肌醇的MS培养基上培养，5周后胚已充分分化，7周后70～80％的胚珠长成了杂种幼苗。20世纪50年代末，植物胚胎学家开始了未授粉胚珠培养的探索，试图闯出离体诱导单倍体的新途径，然而未能成功。20世纪60年代，Tulecke(1964)离体培养未授粉的银杏雌配子体，得到单倍体愈伤组织，但没有分化成植株。在被子植物中Nishi和MitSuoka(1969)对水稻未授粉子房培养产生了二倍体和四倍体植株，但未获得单倍体。20世纪70～80年代，Uchimiya等(1971)从未传粉的玉米子房和茄子的胚珠诱导出愈伤组织，并观察到其中有单倍体细胞的分裂，表明雌配子体人工诱导单倍体植株是可能的。Jenson等进行未授粉棉花胚珠培养诱导了极核融合和分裂，但没有进一步的结果。sanNoeum(1976)首次利用大麦(Hordeumvulgare)为授粉子房培养出单倍体植株。随后国内用未授粉的小麦及烟草子房培育出单倍体植株(祝仲纯和吴海观1979)，以后的报道逐渐增多。经统计目前共对20科40余种种子植物未授粉子房或胚珠进行过离体培养，成功培养出单倍体植株的植物已达10个科、25个种及2变种。研究较多地集中在禾本科、茄科、百合科、葫芦科及菊科，占全部再生植株物种的2／3，尤以禾本科的研究最多，占全部种的l／4多。在水稻(周嫦等，1983；Lieta1．，1998)和非洲菊中已分别建立起可重复的培养流程。该项研究成功的意义在于开辟了单倍体育种的另一途径，这对于花粉培养尚未获得成功和雄性不育的物种尤为重要。并且为实验生殖细胞学，特别是雌核发育的研究建立了良好体系。同时为开展植物的遗传工程提供了新的受体(蔡得田和陈冬玲，1986)。未受精子房和胚珠培养的技术因物种不同而有所差异，但包括以下基本技术程序：（1）选择合适的基因型材料（2）确定合适的接种时期（胚囊单核期至接近成熟时期的材料）（3）确定合适的培养基（4）采用合适的接种方式（5）保温培养（6）染色体鉴定（7）染色体加倍（8）胚囊植株及其后代观察8.2.2子房培养Nitsch(1951)在一种合成培养基上培养了小黄瓜、草毒、番茄、烟草和菜豆等的离体子房，从而奠定了子房培养技术。由已授过粉的花中剥离下来的小黄瓜和番茄的子房发育成了成熟的果实，里面着生着有生活力的种子。然而，这些果实比自然形成的小。同样，在离体条件下发育的摩洛哥柳穿鱼（Linariamacroccana）和旱金莲(Tropaeolummajus)的果实，也不能达到在自然条件下所能达到的大小。Maheshwari和Lal(1958,1961)