园艺植物组织培养第9章

第九章胚培养主要内容9.1胚培养的方法9.2胚柄在胚培养的作用和胚的早熟萌发9.3通过“胚拯救”获得远缘杂种合子胚指的是由雌雄配子融合形成的合子继而发育成的胚。对合子胚进行离体培养的主要目的是获得能正常生长发育的植株。胚培养的研究已经有1个世纪的历史，在被子植物中，Hanning（1904）最早在无菌条件下进行了离体胚培养实验，他当时所培养的是两种十字花科植物-辣根菜和萝卜的成熟胚。后来，很多研究者都由成熟胚的离体培养获得了植株。Dieterich（1924）指出，在含有Knop无机盐和2.5%-5%蔗糖的半固体培养基上，成熟胚能正常生长，但由未成熟种子中剥离的胚不能长出成熟胚的各种结构，而是越过了正常胚胎发生过程中的若干阶段，直接长成幼苗，这种现象称作“早熟萌发”。胚培养方法的进一步发展是受到了Laibach(1925,1929)的推动，这是因为，他首次证实了这种方法在实用上的重要价值。在宿根亚麻和奥地利亚麻的种间杂交中，Laibach发现所结的种子严重皱缩，分量很轻，不能萌发。但是，若把胚由种子中剥离出来，置于潮湿滤纸上或含有蔗糖的棉絮上，则能得到杂交植株。Laibach因此提出，在所有不能形成有生活力种子的杂交中，若把胚剥离出来置于人工培养基上，或许能够起死回生。自此以后，在由于胚的夭折不能形成有生活力种子的情况下，胚培养即被广泛用于产生杂种。胚培养的类型：成熟胚培养：成熟胚培养是指由成熟种子中剥取的胚。成熟胚培养的目的是为了克服种子本身（特别是种皮）对胚萌发的抑制作用。成熟胚培养比较容易，在只含有无机盐、蔗糖和琼脂的培养基上就能长成植株。未成熟胚培养：未成熟胚培养指的是未成熟种子中的胚或夭折之前的远缘杂种胚。进行未成熟胚培养的目的，在前一种情况下是研究胚胎在不同发育时期的营养需求，在后一种情况下是避免杂种胚的夭折。未成熟胚往往不易剥离，而且只有在成分相当复杂的培养基上才能长成植株。未成熟胚培养的成功几率主要取决于胚的发育时期。Monnier（1980）对由球形期开始发育的未成熟胚在活体和离体条件下的发育状况进行了比较。由他的研究可以看出，在离体条件下，胚的生长过度，但发育延迟；在双子叶植物中，一片子叶先长，而不是像在活体中那样两片子叶同时生长。另外，在离体条件下还有形成多个子叶的倾向。取决于植物的种类，胚龄的大小和培养基的组成，未成熟胚在离体培养中可能有3种不同表现：（1）继续正常的胚胎发育过程，最终形成具有萌发能力的成熟胚（2）早熟萌发，形成细弱的畸形苗（3）形成愈伤组织9.1合子胚培养的方法9.1.1选择植物材料对用于胚培养的植物的选择，通常是有所遇到的问题既试验的目的决定的。演示实验选胚易于剥离的植物，如豆科、十字花科植物成熟胚。易获得大量的遗传组成一致又处于同一发育期的胚的植物。（开花和结实都十分规律的植物）荠菜在某些方面能满足这些要求。培养处于一定发育时期的胚：须对刚开放的花进行人工授粉。在这类研究中，最好先制成一个对照表，列出胚胎发育期和授粉后天数的相应关系。培养即将衰亡的胚：从即将夭折的种子中获得植株，则必须在夭折开始之前，将种子剥离下来进行培养。9.1.2消毒合子胚受珠被、子房的双重保护，只需对胚珠、子房消毒即可，然后在无菌的条件下剥出合子胚直接置于培养基上进行培养。9.1.3胚的剥离把胚从周围组织中剥离出来子房种子胚珠胚小种子或胚很小必须借助解剖镜进行先把消过毒的蒴果（图10.2A）放在几滴无菌培养基中。然后切开胎座区域，用镊子将外壁的两半撑开，露出胚珠（图10.2B)。由胎座上取下的1个胚珠放在载玻片的凹穴中（内有1滴培养基），然后用一把锋利的有柄刀片将胚珠纵切成两半（图10.2D)，鱼雷形胚或更幼龄的胚位置都局限在纵向剖开的半个胚珠之中（图10.2D)，由于它们的绿色或由于它们透明的胚柄囊，因而透过合点清晰可见。在剥取这种未成熟胚的时候，将留下有胚的一半，仔细地剔除胚珠组织，即可把连着胚柄的整个胚取出。在剥取较老的胚时，在胚珠上无胚的一侧切一小口（图10.2C)，用一根钝头解剖针轻压珠被，即可把完整的胚挤出到周围的液体中。整个操作过程（特别是在剥取未成熟胚时）必须小心进行，以免使胚受伤。注意：在剥取更小的胚时，要避免它们在操作过程中干掉。9.1.4培养胚乳看护培养在人工培养基上幼龄胚通常很难培养。尽管培养基已经有了不少改进，但胚的夭折若发生在发育的极早期，要想拯救杂种仍有很大困难。放在胚乳旁边在进行未成熟胚离体培养的时候，如果在其周围培养基上存在着来自同一物种另一种子的离体胚乳，对胚的生长会有明显的促进作用。放在胚乳上在某些属间杂交中，若把杂种未成熟胚放在事先培养的大麦胚乳上培养，能够显著提高获得杂种植株的频率。例如：在大麦和黑麦属间杂交中，采用这种方法30%-40%的杂种未成熟胚可以发育成苗，而用传统的胚培养法则只有1%。嵌入胚乳中把杂种离体幼胚嵌人到由双亲之一或第三个物种的正常发育的胚珠取出来的胚乳中，然后把二者一起放在人工培养基上培养。9.1.5对培养基和培养条件的要求Raghavan把胚胎发育过程分为两个时期①异养期：在这个发育早期，胚依赖于由胚乳及周围的母体组织中吸取养分。②自养期：在这个时期胚在代谢上亦能由基本的无机盐和糖合成为生长所需的物质，因而在营养上已相当独立。胚由异养转入自养是胚发育的一个关键时期，但这个时期出现的早晚因物种而异。在荠菜中，胚在球形期以前肯定是异养的，只有到心形晚期它们才转为自养。就是在这两个时期之内，培养中的胚对外源营养的要求也会随着胚龄的增加而渐趋简单。为使胚正常生长，在培养过程中必须把它们由一种培养基转入另一种培养基。Monnier(1976,1978)介绍了一种新的培养方法，用这种方法可以使50μm长（球形早期）的荠菜胚在同一个培养皿中无须变动原来的位置即完成全部发育过程，直至萌发。用于胚培养的无机盐配方很多，互不相同，对其中每种成分的作用并无精确的评价。Monnier(1976)在研究各种标准的无机盐溶液（包括Knop,Heller,MS培养基等）对荠菜胚培养的作用时发现，在一定的培养基上，未成熟胚的生长和存活之间并不存在相关性。1.无机盐在MS培养基中，未成熟胚的生长情况虽然最好，但存活率却很低。在Knop培养基中，虽然它的毒性最小，但胚的生长情况很差。为此他变动了ms培养基中每一种盐分的浓度，以研究这类变动的效果。在这些实验的基础上，他推出了一种新的培养基，在这种培养基上，胚的生长与在MS培养基上一样理想，同时存活率也很高。与MS培养基中的无机成分相比，在Monnier培养基中K十和Ca+的浓度较高，而NH4+的水平较低。据Umbeck和Norstog(1979)报道，培养基中的NH4+对于大麦未成熟胚的正常生长和分化是必需的。当以NO3-作为无机氮的惟一来源时，500μm长的大麦胚在培养中只能略有生长，而这主要是由于细胞伸长造成的。盾片等的分化则需要有4.3-8.6mmol/LNH4+的存在。在曼陀罗和紫花曼陀罗中，特别是对未成熟胚的培养来说，NH4+是必需的，或是一种较好的无机氮；另一方面，黄麻的胚则绝对需要硝态氮。2.碳水化合物和培养基的渗透压蔗糖被认为是最好的碳源。蔗糖的作用有二：①提供能源②调节渗透压，对未成熟胚的培养这个作用更重要。成熟胚在含2％蔗糖的培养基中就能长得很好，但幼龄胚则要求较高水平的碳水化合物。适于原胚的蔗糖浓度一般为8％－12％，随着培养时间的增加，必须转移到蔗糖水平逐步降低的培养基中。Raghavan和Torrey认为，胚在离体条件下的生长和分化在很大程度上并不依赖于渗透压的大小，而主要取决于某些生长调节物质的存在与否。高渗透压阻止离体未成熟胚早熟萌发的作用可以用ABA有效地取代。高渗透压的这种有利影响是否是通过它对内源激素库的作用而表现出来的，还有待今后的实验予以说明。在培养基中加入氨基酸，无论是单一的还是复合的，都能刺激胚的生长。单一氨基酸以谷氨酰胺（Gln）最好，天冬酰胺（Asn）对促进胚的生长也很有效。3.氨基酸和维生素复合氨基酸的作用好于单一氨基酸，可能是氨基酸之间存在着一种协同作用。复合氨基酸中一水解酪蛋白（CH）最好，但胚对CH浓度的敏感程度因物种而异，如毛曼陀罗和曼陀罗的胚在400mg/LCH培养基上生长的最好，50mg/LCH能促进紫花曼陀罗胚的生长，但100mg/L时则有毒害作用。虽然各种维生素一直被用于胚培养中，但它们的存在并非总是必要的。在有些情况下，维生素甚至可能对形态发生过程表现抑制作用。因而，最好是只有在通过试验验证了它们的必要性之后，再在培养基中加入维生素。椰子汁（CM）4.天然的植物浸提物VanOverbeek等（1942）发现，在一种含有1％葡萄糖、1%琼脂、无机盐、甘氨酸、硫胺素、抗坏血酸、烟酸、维生素B6、腺嘌呤、琥珀酸和泛酸的培养基上，曼陀罗鱼雷形期以后的胚能形成正常的幼苗。但心形胚和更幼龄的胚则不能发育。鉴于未成熟胚在胚珠中是被胚乳包围着的，VanOverbeek等（1942)在上述培养基中添加了不经高压灭菌的椰子汁（CM，椰子的液体胚乳），以期培养更幼龄的胚。在这种改良培养基上，这些作者得以由小至150-200μm长（心形期）和幼至授粉后10d的胚获得了正常的幼苗。在椰子汁中存在的这些促进生长的因子被称为“胚因子”。“胚因子”的发现是胚培养史上的一个转折点，此后在若干物种中幼胚培养都获得了成功。为了找到一种适当的物质以能取代椰子汁进行紫花曼陀罗心形期以前幼胚(G150pm长）的培养，Matsubara(1962）曾试验过很多种天然物质，其中包括水解酪蛋白、干酵母、银杏胚乳和若干种被子植物种子得到的浸提物，其中羽扇豆幼龄种子和佛手瓜成熟种子的酒精浸提物与椰子汁效果相同。Kent和Brink(1947)报道，海枣和香蕉浸提物、小麦面筋水解物、牛奶、番茄汁，能够促进大麦未成熟胚的生长和抑制它们的早熟萌发。为了由胚和胚段诱导愈伤组织，通常都需在培养基中加入生长素或细胞分裂素，或二者都加。然而，除了在某些植物中为了打破休眠以外，没有证据表明离体的成熟的或未成熟的胚的正常发育需要生长调节物质。实际上，生长素对于胚的生长通常表现抑制作用。5.生长调节物质Monnier(1978)建议，在胚培养基中不应加人植物激素，以免引起结构异常。他认为胚对大多数生长调节物质都是自主的。在这点上至少对GA3来说已在菜豆上得到了清楚的证明，其中胚柄可以满足离体胚对激素的需要。6.培养基的pH不同植物胚或胚的不同发育阶段对pH要求不同。如紫花曼陀罗心形早期的胚培养最适pH值为5.0—7.5，荠菜的胚培养最适pH值为5.4—7.5。7.培养条件温度：多数在25-30℃之间生长良好。光：一般认为光对于胚的生长不很重要。9.2.1胚柄在胚培养中的作用胚柄是一个短命的结构，长在原胚的胚根一端，一般是当胚达到球形期时胚柄发育到最大限度。有的研究表明胚柄积极参与幼胚的发育过程。9.2胚柄在胚培养中的作用和胚的早熟萌发较老的胚无论有无完整的胚柄在培养中都能正常的生长，幼胚若去掉胚柄就会显著降低形成小植株的频率。胚柄在胚培养中的作用：①产生生长调节物质，特别是GA3。②去掉胚柄会引起胚的损伤。由于胚柄既小又易受损伤，很难把它与胚一起剥离出来，因而在一般情况下培养的胚都不具完整的胚柄。然而有些研究指出，在培养中胚柄的存在对于幼胚的存活是个关键因素。Cionini等（1976)看到，在红花菜豆中．虽然较老的胚(500pm或更长）无论有无完整的胚柄在培养中都能正常生长，然而在幼胚培养中，去掉胚柄就会显著降低形成小植株的频率。Yeung和Sussex(1979)指出，和无胚柄的胚培养相比，若胚柄完整地连在胚上，或虽与胚分离但在培养基上与胚紧紧相靠，则会显著刺激胚的进一步发育。按照这些作者的看法．胚柄促进生长的活性在胚的心形早期达到高潮。在所试验过的各种生长调节物质中，浓度为5mg/L的赤霉素最能有效地取代胚柄的作用。这个发现与Alpi等（1975)的实验结果一致。Alpi指出，在红花菜豆中，心