单抗制备工艺

单克隆抗体制备主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、单抗的鉴定及制备等。1动物免疫根据抗原的特性选择合适的免疫方案，对于可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂。常用佐剂为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状。（1）初次免疫，Ag50ug/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，一般1.5ml,间隔3周。（2）第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周。（3）第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，7天后采血测其效价，检测免疫效果，间隔3周。（4）加强免疫，剂量50ug，腹腔注射。（5）3天后，取脾融合。2细胞融合（1）饲养细胞的制备在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞小鼠腹腔巨噬细胞的准备：①用6-10周龄的BALB/c小鼠。②拉颈处死，浸泡于75%的酒精，消毒3min,用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。用吸管注入6ml培养液，反复冲洗，吸出冲洗液。③放入10ml离心管，1200rpm离心5min.④用20%小牛血清的培养液混悬，调整细胞数为1*105/ml.加入96孔板，100ul/孔。放入37度孵箱培养。（2）骨髓瘤细胞的准备①于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养②融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。③1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。④加入30ml不完全培养基，离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。⑤取骨髓瘤细胞悬液，加0.4%台酚蓝染液作活细胞计数后备用。（3）脾细胞的准备取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。通常每只小鼠1×108-2.5×108个脾细胞。（4）细胞融合①将1×108脾细胞与1×107骨髓瘤细胞SP2/0混合于一支50ml融合管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。②1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。③在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;④用1ml吸管在30s内加入预热的50%PEG1ml，边加边轻轻搅拌。⑤吸入吸管静置1min。⑥加入预热的不完全培养液，终止PEG作用，连续每2min内分别加入1ml,2ml,3ml,4ml,5ml,10ml.⑦800rpm,5分钟；弃去上清。⑧加入5ml完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加完全培养基至40-50ml。分装96孔细胞培养板，每孔100ul,然后将培养板置37℃，5%CO2培养箱内培养。⑨6h后补加选择培养基。每孔50ul.3天后用选择培养基半换液。⑩.经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。（5）杂交瘤细胞的选择①抗原用包被液稀释至10ug/ml。②以100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。③弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干。④每孔加100ul封闭液37℃封闭1小时；⑤洗涤液洗3次；⑥每孔加100ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1小时；洗涤，拍干。⑦加酶标第二抗体，每孔100ul，37℃孵育1小时，洗涤，拍干。⑧加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液100ul，37℃20分钟。⑨以2mol/LH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。⑩结果判定：以P/N≧2.1，或P≧N+3SD为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果（6）杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法）①制备小鼠脾细胞为饲养细胞。②制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含5、10和20个细胞3种不同的稀释度。③按每毫升加入5×104-1×105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。④每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每孔量为100ul.⑤37℃、5%CO2培养6天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。⑥取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。3单克隆抗体的Ig类与亚类的鉴定①以10ug/ml浓度的抗原包被酶标板，50ul/孔，4℃过夜。②洗涤后，加入待检的单抗样品，100ul/孔，37℃1小时；设阴性、阳性对照孔。③洗涤后，加入HRP标记的抗小鼠类及亚类Ig的抗体试剂，100ul/孔，37℃避光显色20分钟；用2mol/LH2SO4终止反应后，根据颜色判断抗体的亚型。4单克隆抗体的生产及纯化（1）动物体内生产单抗①成年BALB/c小鼠腹腔接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5ml。②7-10天后腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠5×105/0.2ml。③间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可采集腹水。通常每只小鼠可采3ml腹水；④将腹水离心（2000r/min5分钟），除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-70℃冻存备用。（2）单克隆抗体的纯化（辛酸-硫酸铵沉淀法）①腹水4℃12000rpm离心15min,去除杂质。②取1份腹水加2份0.06mol/LPH5.0醋酸缓冲液，按每毫升稀释腹水加33ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，室温混合30min③4℃静置2小时，取出12000g离心30分钟，弃沉淀；④上清经尼龙筛过滤，于50倍体积的0.01MPH7.4PBS中4℃透析6h.⑤在透析后的上清中加入等体积饱和硫酸铵溶液。⑥4℃静置1h以上，10000g离心30分钟，弃上清。⑦沉淀溶于适量PBS（含137mmol/LNaCl，2.6mol/LKCl，0.2mmol/LEDTA）中，于50-100倍体积的PBS中透析过夜。⑧取少量透析后样品适当稀释后，以紫外分光光度计检测蛋白含量，SDS-PAGE，WB检测抗体纯度。