缓冲液的配制

Elisa相关试剂的配制1、抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/LpH7.2PBSNaH2PO4·2H2O——0.39克；Na2HPO4——1.27克；NaCl——0.85克；NaN3——200mg；H2O（蒸馏水）至1000ml2、ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液PH7.4，PBSTNaCl——2.0克；KH2PO4——0.2克；Na2HPO4·12H2O——2.9克；KCl——0.2克；NaN3——0.2克；H2O至1000ml吐温（Tween）200.5ml；4°C保存备用3、包被液（简称CB）pH9.6Na2CO3——1.59克；NaHCO3——2.93克；NaN3——0.2克；H2O至1000ml密封盖好，4°C存放备用4、ELISA底物液（可溶性底物）磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.00.1mol/L柠檬酸（21.014克/100ML）——24.3ml；0.2mol/LNa2HPO4（28.4克/L)——25.7ml；H2O——50ml；4°C存放备用5、DAB底物液（不溶性底物，组化病理等）0.05mol/LpH7.6tris-HCLTris——6.05克；HCL(36%)——3.15克（约2.7ml浓HCL）；H2O至1000mlDAB为3´，3´二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色ELISA试剂配制及实验流程是酶联接免疫吸附剂测定((Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的简称。以双抗体夹心法举例说明。试剂配制：(1)包被缓冲液(PH9.6+0.20.05M碳酸盐缓冲液)：Na2CO3——1.59g;NaHCO3——2.93g；加蒸馏水至1000ml。（用时稀释成1x，加0.1%BSA）(2)洗涤缓冲液(PH7.40.15MPBST)：0.05%Tween-20——0.5ml；加在PBS缓冲液1000ml中。PBS缓冲液：KH2PO4——0.2g；Na2PO4·12H2O——2.9g；NaCl——8g；KCl——0.2g；加蒸馏水至1000ml。(3)封闭缓冲液：牛血清白蛋白(BSA)2%——2g；（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。(4）稀释液：牛血清白蛋白0.1%——0.1g；加PBS缓冲液100ml。(5）底物缓冲液（PH5.0）：0.2MNa2HPO4(无水28.4g/L，带12结晶水71.7g/L)取25.7ml0.1M柠檬酸(无水19.2g/L，带1结晶水21.01g/L)取24.3ml；加蒸馏水至100ml。(或Na2HPO4·12H2O——1.84g；柠檬酸·H2O——0.51g加蒸馏水至100ml)(6)TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：TMB(2mg/ml水)——0.05ml；底物缓冲液——0.95ml；30%H2O2——0.001ml；总体积1ml。(7)或配OPD(邻苯二胺)显色液（显黄棕色）（现配避光）：OPD（干粉）——0.004g；底物缓冲液——10ml；30%H2O2——0.015ml；总体积——10ml。(8)终止液(2MH2SO4)：在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)21.7ml，边加边摇。操作步骤：1.包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。(简称洗涤，下同)。2.封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。然后洗涤3次3.加样：加待检样品0.1ml于反应孔中，置37℃温育1~2小时。然后洗涤。(同时做空白孔（不加样品），阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔)。4.加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。置37℃温育1~2小时。然后洗涤。5.加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。6.加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD显色液），37℃暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。7.终止反应：各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）8.结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。4间接法操作步骤：1.包被：用包被液将样品稀释（梯度稀释，比例自己定）4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次（5至7次），中间振荡。(简称洗涤，下同)。2.封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。然后洗涤。3.加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。置37℃温育1~2小时。然后洗涤。4.加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。5.加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD显色液），37℃暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。6.终止反应：各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）7.结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。孕酮1包被缓冲液，（1）碳酸盐缓冲液（PH9.6+0.20.05M）Na2CO3——1.59g；NaHCO3——2.93g；加蒸馏水至1000ml。（2）tris缓冲液（0.05mol/L）50ml0.1mol/L（Tris）溶液与xml0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml各种pH值的Tris缓冲液的配制所需pH值（25℃）0.1mol/LHCl的体积7．145．77．244．77．343．47．442．07．540．37．638．57．736．67．834．57．932．08．029．28.126.28.222.98.319.98.417.28.514.78.612.48.710.38.88.58.97.0某一特定pH值的0.05mol/LTris缓冲液的配制：将50ml0.1mol/LTris碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的0.1ml/LHCl混合，加水将体积调至100ml0.1mol/L盐酸的配置：买来的浓盐酸是12mol/L的，以配制1L0.1mol/L的盐酸为例：先用量筒量取8.3mL的浓盐酸倒入容量瓶，然后将溶液加蒸馏水稀释至体积为1L，此时的溶液就是0.1mol/L的盐酸。0.1mol/Ltris的配置：0.1mol/L溶液为12.114g/L则配制600mlTris缓冲液的方法：三羟甲基氨基甲烷：3.6g浓盐酸：2.09ml3）0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)磷酸二氢钾——0.2g；磷酸氢二钠——2.90g；氯化钠——8g；加去离子水定容到1000ml。2洗涤缓冲液（pH7.40.15mol/L）0.05%Tween-20——0.5ml；加在PBS缓冲液1000ml中。PBS缓冲液：KH2PO4——0.2g；Na2HPO4·12H2O——2.9g；NaCl——8.0g；KCl——0.2g加蒸馏水至1000ml。3测定缓冲液(Ph7.0含0.87﹪NaCl和0.1﹪BSA的0.1M磷酸缓冲液)用于标准孕酮，孕酮酶标物及奶样的稀释。Na2HPO4·12H2O——21.85g；NaH2PO4·2H2O——6.08g；NaCl——8.70g；BSA——1.00g溶于1000mL蒸馏水中4封闭缓冲液牛血清白蛋白(BSA)2%——2g；（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)+2.0%BSA2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml5底物缓冲液（pH5.4）磷酸盐-柠檬酸缓冲液0.2MNa2HPO4(无水28.4g/L，带12结晶水71.7g/L)取25.7ml0.1M柠檬酸(无水19.2g/L，带1结晶水21.01g/L)取24.3ml加蒸馏水至100ml。或柠檬酸（C6H8O7·H2O）——0.47g；Na2HPO4·12H2O——2.00g；6（1）TMB(四甲基联苯胺)显色液（蓝色）A液(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，TMB):称取TMB20mg溶于10ml无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至100ml。B液(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4):称取Na2HPO4·12H2O14.34g，柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水，加0.75%过氧化氢尿素1.28ml，定容至200ml，调pH至5.0-5.4。将A液和B液按1：l混合后即成TMB-过氧化氢尿素应用液或TMB(2mg/ml水)——0.05ml：底物缓冲液——0.95ml；30%H2O2——0.001ml；总体积1ml。（2）OPD(邻苯二胺)显色液（黄棕色）（现配避光）OPD（干粉）——0.004g；底物缓冲液——10ml；30%H2O2——0.015ml；总体积10ml。（3）TMBS底物液（用于显色）10mg四甲基联苯胺硫酸盐（TMBS）的二甲基亚砜溶液，用底物缓冲液配成0.2mg/ml的TMBS底物液。用前加H2O2溶液30﹪左右。7终止液2mol/LH2SO4用于终止反应在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)21.7ml，边加边摇。（浓H2SO4：蒸馏水=1:9）抗原修复液：根据待检测的抗原，选择适当的方法附：抗原修复液（10mMpH6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制（1）储备液的配制：A：枸橼酸三钠-2H2O29.41g+1000mlB:枸橼酸21g+蒸馏水1000ml工作液的配置：A液82ml+B液18ml+蒸馏水900ml抗原修复方法：高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM,PH6.0）,淹没切片，盖上高压锅，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）微波处理技术：用塑料切片架，置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中或高档，5分钟；取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中或高档，5分钟（最佳温度92~95℃）抗原修复注意事项：组织不能干，选择抗原修复方法要因抗体而异。该方法主要用于10%福尔马林固定，石蜡包埋组织。抗原修复后至DAB显色的过程中，均要用PBS缓冲液。DAB的配制：储备液（DAB25mg/ml）的配置：DAB250mg+pbs10ml，待完全溶解后分装成1ml,100ul。50ul，20ul，等—20℃冻存。工作液：DAB储存液20ul+PBS1000ul+3%H2O25ul;2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。3．0.5mol/LEDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA&8226;2H2O,用10mmol/LNaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4.1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水1000ml。酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6.3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合b油