!T-cadherin基因失活与原发性肝癌恶性生物学特征的关系及其临床意义

申请代码：受理部门：收件日期：受理编号：检查保护国家自然科学基金申请书资助类别：亚类说明：附注说明：项目名称：申请者：电话：依托单位：通讯地址：邮政编码：单位电话：电子邮件：申报日期：2004年3月9日国家自然科学基金委员会您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作：1)如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:中方法:Word菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中(如果您是Word97用户，继续执行以下步骤)2)关闭本文档，重新打开本文档3)点击启用宏按钮，即可开始填写本文档或打印了国家自然科学基金申请书第2页版本1.009.485基本信息yEKHuo0AOsK申请者信息姓名[在此录入修改]性别出生年月年月民族学位职称主要研究领域电话电子邮件传真个人网页工作单位在研项目批准号依托单位信息名称华中科技大学代码43007402联系人张婷姣电子邮件[e-mail]电话[phone]网站地址[在此录入修改]项目基本信息项目名称T-cadherin基因失活与原发性肝癌恶性生物学特征的关系及其临床意义资助类别面上项目亚类说明自由申请项目附注说明申请代码C03030303:普通外科学C03031901:实验肿瘤学基地类别预计研究年限2005年1月—2007年12月研究属性应用基础研究摘要项目研究内容和意义简介（限400字）：细胞粘附分子T-cadherin（T-cad）基因在肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中因启动子甲基化而失活，其表达显著下降或缺失，推测其可能为一新的肿瘤抑制基因。申请人首次证实T-cad基因在脑胶质母细胞瘤C6细胞中的肿瘤抑制基因功能，并揭示其分子机制。本研究将在肝癌细胞株进一步研究T-cad基因失活与肝癌细胞的增殖及侵袭等恶性生物学特征的关系，并调查其分子机制；在临床切除的肝癌标本中研究T-cad基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，明确T-cad基因失活与临床肝癌预后的关系；在肝癌细胞株和肝癌裸鼠模型上证实去甲基化药物是否能重新诱导T-cad分子表达并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学特征，探索去甲基化药物对肝癌的治疗价值。该研究对进一步揭示肝癌发病的分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后，提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。关键词(用分号分开，最多5个)T-cadherin；肿瘤抑制基因；肝癌国家自然科学基金申请书第3页版本1.009.485项目组主要成员(杰出青年科学基金不填此栏)编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间（月）1[在此录入修改]2[在此录入修改]3[在此录入修改]4[在此录入修改]5[在此录入修改]6[在此录入修改]7[在此录入修改]8[在此录入修改]9[在此录入修改]总人数高级中级初级博士后博士生硕士生10321121说明:1.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。说明:2.项目组主要成员不包括项目申请者。国家自然科学基金申请书第4页版本1.009.485经费申请表（金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费17.50001.科研业务费2.9000（1）测试/计算/分析费0.5000统计分析及数据处理费（2）能源/动力费0.4000水电费（3）会议费/差旅费1.0000参加国内学术会议4-5人次（4）出版物/文献/信息传播费1.0000论文准备及发表（5）其它2.实验材料费5.5000（1）原材料/试剂/药品购置费4.0000购置各种抗体、脂质体（2）其它1.5000购买氚标胸腺嘧啶、去甲基化试剂、合成引物3.仪器设备费4.5000（1）购置3.0000购买小型冰冻切片机、动物解剖器材及消耗性器材（2）试制1.5000各种常规试剂4.实验室改装费2.0000建立动物解剖工作台及同位素实验专区5.协作费2.6000委托动物中心维持约100只裸鼠约1年的饲养及管理；流试细胞仪分析二.国际合作与交流费3.50001.项目组成员出国合作交流1.0000参加国际会议一次2.境外专家来华合作交流2.5000邀请Gutmann教授来院指导课题进展及专题讲座2-3次三.劳务费四.管理费1.0000合计22.0000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计0.0000国家自然科学基金申请书第5页版本1.009.485查看报告正文撰写提纲报告正文（一）立项依据与研究内容1、项目的立项依据原发性肝癌是高度恶性的肿瘤，尽管采取积极手术治疗，但绝大多数病人仍难免死于肿瘤复发及转移，其死亡率高居我国肿瘤死亡率的第二位。研究已表明肝癌的发生乙肝、丙肝感染及摄入黄曲霉素污染的食物有密切关系,其发生发展与多种癌基因过度表达，以及肿瘤抑制基因失活密切相关。但目前对其发生发展的精确分子机制尚不完全清楚。因此,进一步探索研究新的基因功能改变与肝癌发生发展及其恶性特征的关系，对揭示其发生发展的精确分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后，进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。T-cadherin分子属细胞粘附分子cadherin超家族。Cadherin超家族分子为细胞表面糖蛋白，其功能主要包括调节钙介导的细胞粘附、细胞极性及形态形成，以及参与细胞间的识别和信号传导机制(1,2,3,4)。经典的Cadherin分子如E-cadherin和N-cadherin由细胞外钙结合区及跨膜区两部分组成，而T-cadherin因缺失经典Cadherin分子所具有的跨膜区而经糖基磷脂酰肌醇分子附着于细胞膜上（5）,故而命名truncated-cadherin（即T-cadherin，又称CDH13或H-cadherin）。近年来对经典的Cadherin分子的深入研究发现，E-，N-cadherin分子缺失或突变与多种肿瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌的发生及转移特征密切相关（6，7，8,9,10）。将E-cadherin分子重新导入缺失E-cadherin分子表达的肿瘤细胞，则肿瘤细胞的增殖及侵犯能力显著受抑（11）。近年已开始有T-cadherin分子在肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌及皮肤鳞癌中表达显著下降、缺失的报导（12，13，14，15,16,17,18），推测T-cadherin分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤抑制基因角色,但尚无人对其在不同肿瘤中的基因功能及其分子机制进行研究。2003年，申请人（黄志勇）最新研究表明，将T-cadherin基因导入缺失表达T-cadherin分子的大鼠脑胶质母细胞瘤C6细胞使其过度表达T-cadherin分子，C6细胞的增殖及侵袭能力显著受抑，首次证实T-cadherin在大鼠脑胶质母细胞瘤中的肿瘤抑制基因功能，并进一步揭示其抑制机制是T-cadherin分子通过诱导P21CIP1/WAF1表达致使肿瘤细胞于细胞周期G2期阻滞。该文发表于MolecularandCellularBiology2003,23:566-578（19）。这一研究发现为进一步研究T-cadherin国家自然科学基金申请书第6页版本1.009.485分子在肝癌中的功能、分子机制及临床意义奠定了坚实的基础。肿瘤抑制基因启动子甲基化导致基因失活在肿瘤的发病机制中起着重要作用（20，21，22，23）。T-cadherin基因在乳腺癌、结直肠癌及肺癌中并未发生缺失突变，但由于其启动子异常甲基化导致T-cadherin基因失活，进而导致其蛋白表达水平显著下降或缺失（13,16,24）。T-cadherin基因位于染色体16q24，肝癌的发生与染色体16q24的缺失、突变密切相关(25)。Riou（2002）对位于染色体16q24的13个常常在肝癌中缺失表达的基因的转录研究发现，T-cadherinmRNA在HepG2,PLC/PRF/C,TONG和HA22TNGH四种肝癌细胞株中缺失表达，但T-cadherin基因本身并未发生缺失突变（12）。Yu（2002）进一步研究显示T-cadherin基因启动子在肝癌中高度甲基化，而E-cadherin基因启动子在肝癌中不发生甲基化，表明在Cadherin细胞粘附分子超家族中T-cadherin基因启动子甲基化在肝癌中具有高度特异性,且T-cadherin基因启动子甲基化与T-cadherin基因失活密切相关（26）。这些研究表明T-cadherin基因启动子甲基化是T-cadherin基因在肝癌中失活的主要机制。Takeuchi在对皮肤鳞癌细胞株的研究中发现，与2ug/ml去甲基化药物5-aza-2’-deoxycytidine共孵6天能使皮肤鳞癌细胞株恢复T-cadherin分子表达（17）。但目前对T-cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、肝内转移及复发等恶性生物学特征的关系，以及应用去甲基化药物是否能诱导T-cadherin分子在肝癌细胞株中重新表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性特征全世界尚无研究报道。本研究将进一步研究T-cadherin在肝癌中的基因功能，调查缺失表达T-cadherin的肝癌细胞株重新表达T-cadherin是否能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，并在裸鼠肝癌模型上加以证实。同时，进一步研究其基因功能的分子机制。在临床切除的肝癌标本中研究T-cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，进一步揭示T-cadherin基因失活与临床肝癌预后的关系。在肝癌细胞株及裸鼠肝癌模型上证实是否去甲基化药物能重新诱导T-cadherin分子表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其潜在的治疗作用和可能的毒副作用。由于国内外尚无类似研究报道，申请人具有研究T-cadherin基因与C6细胞恶性生物学特征的关系及其分子机制的丰富经验，预期该研究成果能达国际先进水平。主要参考文献：1.AngstBD,MarcozziCandMageeAI.Thecadherinsuperfamily:diversityinformandfunction.JCellSci.,2001,114:629-641国家自然科学基金申请书第7页版本1.009.4852.KemlerR.Classiccadherins.Semin.CellBiol.,1992,3:149-1553.KollerE,RanschB.DifferentialtargetingofT-andN-cadherininpolarizedepithelialcells.JBiolChem.,1996,271:30061-300674.TakeichiM.Cadherincelladhesionreceptorasamorphogeneticregulator.Science1991,251:1451-14555.Angst,B.D.,Marcozzi,c.,andMagee,A.L.TheT-cadherinsuperfamily:diversityinfromandfunction.J.CellSci2001,114:629-6416.Berx,G.,and.VanRoy,F..TheE-cadherin/catenincomplex:animportantgatekeeperinbreastcancertumorigenesisandmalignantprogression.BreastCancerRes.2001,3:289-293.7.Bremnes,R.M.,VeveR.,Gabrielson,E.etal.High-throughputtissuemicroarrayanalysisusedtoevaluatebiologyandprognosticsignificanceoftheE-cadherinpathwayi