ENU与疾病动物模型

ENU诱变与疾病动物模型邵义祥人类遗传性疾病人类群体中约20%～25%的人都患有不同种类、不同程度的遗传相关疾病。人类遗传学研究表明：4～5%新生儿患有遗传病，40%的低智能儿童是由遗传因素造成。现代医学研究已证实：癌症、糖尿病、冠心病、动脉粥样硬化、高血压病和精神分裂症等常见病与遗传因素密切相关。人类疾病动物模型的用途由于个体遗传背景的差异及研究材料的限制，人类遗传疾病的深入研究必须通过动物模型实现。利用动物模型进行遗传疾病机理的深入研究借助动物模型进行实验性矫正或治疗获得人类遗传病动物模型的方法自发性动物模型基因组改造和修饰基因组诱变基因驱动法与表型驱动法基因敲除与插入——基因驱动特点：基因结构明确；时间长，代价高，效率低。诱导点突变——表型驱动特点：高通量，大规模，表型明确；随机。小鼠是第二个完成全基因组测序的哺乳动物。人类疾病有关的遗传基因中的90%在小鼠身上有相似的效果。小鼠容易获得，世代间隔短，饲养、管理、实验操作方便。小鼠是研究人类疾病和基因功能的最为理想的模式动物，成为研究人类疾病和试验新的治疗手段的理想模型。小鼠在人类遗传病研究中的独特作用ENU诱变技术随着越来越多的基因和微卫星标记被定位，突变基因的定位也会随之变得容易，因此对小鼠进行化学诱变将越来越变得低成本而高效益。ENU（ethylnitrosourea）致突变技术是高通量大规模筛选新基因及发育突变技术的化学诱变方法。ENU诱变是一种表型诱变技术，研究者无需知道哪个基因以及这些基因的突变类型，即可直接针对某一未知基因突变导致的特定表型或疾病进行研究ENU的结构（N-ethyl-N-nitrosourea）ENU诱变机制•烷基化反应•作用位点：A：N1、N3、N7G：O6、N3、N7C：O2、N3T：O2、O4、N3•复制、错配、未修复导致单碱基突变screeningandtestingfordominantmutants•screeningandtestingforrecessivemutants指标分类具体指标一般状况精神状态、体重、体形、营养状况神经行为步态、摇头、转圈、震颤、活动状况皮肤、毛发皮色、皮质、毛色、毛质、胡须、斑点、淤斑、纹理眼位置、大小、形态、颜色、角膜、虹膜、有无白内障耳耳廓位置、形态、大小、外耳道是否闭锁尾长短、粗细、形态、颜色骨骼头形、有无下颌、脊柱侧弯、四肢长短粗细、趾数多少，趾长短、并趾口腔牙齿长短、色质、质地、角度；舌的形态、色质；有无腭裂尿、粪尿液颜色、浑浊度；粪便颜色、质地血生化血糖、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素氮血常规白细胞数、红细胞数、血红蛋白、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量其它水肿、脑积水、腹水、脊柱裂诱变小鼠的筛查项目ENU诱变的历史和现状•ENU诱变开始于上个世纪70年代，初期主要应用在肿瘤研究领域；•在1985年左右，开始有报道用ENU诱变雄鼠而在后代当中获得突变系小鼠，这些突变小鼠某些酶的活性发生了改变；•1995年以后，开始在世界范围内得到开展并主要用于基因功能的研究；•1994年King等通过诱变获得生活规律异常的小鼠，1997年克隆了clock基因，这是表明ENU诱变技术独特优势的里程碑。国外进展•德国GSF1997-2003年期间共建立突变系小鼠267种，其中隐性突变50种，半显性突变5种，其余均为显性突变；•到2000年英国MRC筛查突变小鼠26000只，得到突变系小鼠500种；•到目前为止，世界上ENU诱变获得的突变系小鼠已有1000多种。国内进展•南京大学和扬州大学共同承担的“国家小鼠遗传资源库”项目，其中一项重要工作就是开展小鼠ENU诱变研究。2002-2004年资源库共建立了具有自主知识产权的转基因/基因剔除/化学诱变小鼠共167种，其中ENU诱变获得的有117种，在此基础上克隆了7个突变基因。•清华大学生物科学与技术系发育生物学实验室用ENU诱导斑马鱼突变一共得到35种突变体。ENU诱变建立疾病动物模型•心血管疾病、代谢性疾病、神经系统疾病、免疫性疾病、肿瘤和出生缺陷等遗传高度相关性疾病已成为国际上生物医学研究的最热门领域，相应的实验动物学支撑，特别是相关疾病的动物模型的获得和建立成为了实验动物学研究的热点。小鼠疾病模型的开发与保种•美国的Jackson实验室保存了近2500多个品系的小鼠模型；•英国MRC的哺乳类遗传学中心保存了1000多个品系的小鼠资源；•意大利的欧洲小鼠突变系保存中心每年以开发150个突变系小鼠的速度建立了数百个基因工程小鼠模型；•日本的熊本大学实验动物资源开发研究中心(CARD)自2000年建立以来，已收集保存了700多个转基因和基因剔除小鼠模型。•国家遗传工程小鼠资源库建立以来，已收集、开发了264种小鼠模型品系。模型种类包括：糖尿病模型、生殖缺陷模型、心衰模型、生长迟缓模型、骨密度异常模型、肢体发育缺陷模型、听力异常模型、眼发育异常模型、稀毛、毛色变异模型等等。•目前，世界上数以千计新的小鼠品系，模拟人类代谢性疾病、自身免疫疾病、老年性疾病和神经系统疾病的动物模型正在不断通过ENU诱变这个高通量筛选技术建立起来，进而相关基因被定位和克隆。随着基因组计划的进行，从表型到基因克隆的方法目前也日渐成熟和简化。ENU在建立人类疾病动物模型和开展基因功能研究中的主要优势•①在相对短的时间内诱导产生较多的突变系小鼠，获得许多基因包括新基因的功能信息；•②只要得到能够遗传某种表型的突变小鼠，就可以通过配种形成任意控制的“超大家系”；•③小鼠近交系有数百种，其中12个品系的微卫星数据已经建库且免费开放，便于对突变基因的定位及克隆；•④小鼠与人类病理过程的相似性，通过克隆小鼠的致病基因就可以通过同源检索得到人类的相应疾病的基因；•⑤ENU诱变无需知道哪个基因以及这些基因的何种突变导致特定的表型或疾病，这也使得发现新基因成为可能。•⑥ENU诱导的某些突变，导致非致死的表型和改变蛋白质的部分功能，而不是完全废弃，因此增加了研究者鉴定突变体的机会，而该突变体含有对某个基因座的丰富信息。总之，以ENU诱变为手段，通过模式小鼠研究功能基因或人类疾病已成为一种很有前景的手段和捷径。我们的部分研究工作•突变系小鼠的获得•两种突变小鼠突变基因的定位•两种突变小鼠模型性状的初步研究ENU诱变、突变表型筛选及遗传试验技术路线ENU处理C57BL/6雄鼠3个月后与同品系母鼠配种子代小鼠（G1）离乳G1饲养至2月龄阳性突变小鼠G1同品系配种得G2具有亲代G1突变表型显性遗传突变基因的定位技术路线B6突变系与DBA/2交配，获得阳性表型的F1F1回交DBA得到F2代提取阳性表型的F2鼠尾DNA选择相关基因附近的微卫星优先连锁分析计算LOD值确定连锁在G1代小鼠中，针对肉眼可见的神经行为、皮肤、毛发、五官、骨骼等可见表型筛查突变个体。筛查G1小鼠1650只，获得突变小鼠48只。在对G1突变小鼠的遗传试验及突变系小鼠保种过程中，繁殖小鼠1468只，确认能够稳定遗传的只有短尾、角膜浑浊和瞳孔异形突变小鼠等共7种，经卡方检验都属于单基因显性遗传。小鼠的ENU诱变结果突变基因的微卫星定位体系•D1Mit372、D1Mit84、D1Mit273、D2Mit6、D2Mit17、D2Mit528、D3Mit268、D3Mit15、D4Mit17、D4Mit54、D5Mit352、D5Mit168、D6Mit274、D6Mit339、D7Mit246、D7Mit333、D8Mit4、D8Mit320、D9Mit325、D9Mit243、D10Mit3、D10Mit73、D11Mit163、D11Mit258、D12Mit136、D12Mit17、D13Mit18、D13Mit262、D14Mit50、D14Mit205、D15Mit226、D15Mit34、D16Mit189、D16Mit100、D17Mit33、D17Mit39、D18Mit52、D19Mit128、D19Mit33。泳道1：野生型D2品系小鼠对照；泳道2－17：F2角膜浑浊小鼠的检测结果，其中第9泳道发生重组，其余连锁。F2代B6角膜浑浊小鼠的微卫星检测角膜浑浊小鼠突变基因的连锁分析角膜浑浊小鼠突变基因的染色体定位D17Mit33与D17Mit143聚丙烯酰胺凝胶电泳结果上图：第4泳道发生重组下图：无1例发生交换，12、13、14分别为D2、F1、B6F2代短尾小鼠的微卫星检测短尾鼠的突变基因连锁分析228只F2[（B6×D2）×D2]109只短尾短尾突变基因与各微卫星的连锁分析短尾小鼠突变基因的染色体定位角膜浑浊突变小鼠的生物学特性初步研究突变品系的建立及其模型性状研究的技术路线突变杂合子繁殖学指标生长发育血常规血液生化免疫学指标病理组化建立新的模型品系形态行为观察角膜浑浊小鼠角膜浑浊小鼠和野生型小鼠的繁殖学指标比较角膜浑浊小鼠后代的性别比(♂:♀)为：1.07有角膜浑浊表型的性别比(♂:♀)为：1.44突变表型发生率（%）品系平均窝仔数离乳成活率（%）♂♀合计平均胎间隔(天）B66.33±2.06(938/1092)85.900033.2±12.1B6-Co6.02±2.00(193/242)79.825.3917.62(83/193)43.0134.6±8.7B6和角膜浑浊后代正常和异常表型生长发育曲线0510152025303540初生51015202530405060日龄（天）体重（g）B6B6-ConB6-CoaB6-Co与正常B6小鼠的脏器系数组别正常B6♂正常B6♀角膜浑浊♂角膜浑浊♀心0.595±0.0450.572±0.0290.586±0.0660.557±0.029肝4.680±0.3734.765±0.4564.719±0.2944.570±0.307肺0.635±0.0600.745±0.0890.686±0.0370.761±0.051脾0.280±0.0630.368±0.0280.223±0.0410.355±0.066肾1.465±0.1051.416±0.0831.473±0.0861.443±0.086脑2.087±0.1422.484±0.1532.560±0.246*2.670±0.257睾丸0.854±0.0770.863±0.081子宫0.483±0.0990.282±0.052*卵巢0.080±0.0100.061±0.024角膜浑浊突变系与正常B6小鼠血常规的比较淋巴细胞单核细胞（×109/L）（×109/L）正常组3.11±2.190.46±0.135.04±1.830.01±0.01角膜异常组2.71±1.860.56±0.085.27±0.980.05±0.05正常组7.64±3.1044.42±5.73523.87±119.70140.60±9.66角膜异常组8.37±0.4844.25±5.87536.87±94.42*135.27±5.68血小板(×109/L）血红蛋白（g/L）组别白细胞（×109/L）中性粒细胞（×109/L）组别红细胞(×1012/L）红细胞压积（%）角膜浑浊突变系与正常B6小鼠血液生化值的比较组别碱性磷酸酶(U/L)血清总蛋白(g/L)白蛋白(g/L)球蛋白(g/L)正常组253±31.09365.33±9.6337.52±3.3327.81±6.81角膜异常组284.17±37.6158.07±2.74*36.09±0.99*21.97±2.04*组别白/球(%)血清总胆固醇(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)高密度脂蛋白(mmol/L)正常组1.39±.0212.59±0.500.95±0.421.25±0.33角膜异常组1.65±0.14*1.98±0.34*0.48±0.161.03±0.23组别低密度脂蛋白(mmol/L)空腹血糖(mmol/L)血清尿素氮(mmol/L)血清肌酐(umol/l)正常组0.17±0.097.01±2.2411.41±3.2566.