takaraSYBR说明书

研究用CodeNo.RR420L说明书SYBR®PremixExTaq™(TliRNaseHPlus),Bulkv201412Da目录内容页码●制品说明1●试剂盒原理1●制品内容2●试剂盒外必备主要试剂和仪器2●保存2●使用注意2●操作方法3●附录9●关联产品12●制品说明本制品是采用SYBR®GreenI*1嵌合荧光法进行RealTimePCR的专用试剂。制品中含有RealTimePCR反应的最适浓度SYBR®GreenI，是一种2×浓度的PremixType试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。制品中使用了抗Taq抗体的的HotStart法用DNA聚合酶TaKaRaExTaqHS，与RealTimePCR用最适Buffer组合，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，可以进行高灵敏度的RealTimePCR扩增反应。另外，本制品中添加了TliRNaseH(耐热性RNaseH)，以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以最大限度抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。本制品适合于快速RealTimePCR扩增反应，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。适用的RealTimePCR扩增仪ThermalCyclerDiceRealTimeSystem(CodeNo.TP850/TP870)*2SmartCycler®IISystem＊3（Cat.#SC200N/SC210N）AppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystem(LifeTechnologies)AppliedBiosystems7500FastReal-TimePCRSystem(LifeTechnologies)StepOnePlus™Real-TimePCRSystem(LifeTechnologies)LightCycler®/LightCycler®480System(RocheDiagnostics)CFX96Real-TimePCRDetectionSystem(Bio-Rad)*1：TakaraBio使用SYBR®GreenI作为研究试剂已得到MolecularProbesInc.的许可。SYBR®为MolecularProbesInc.的注册商标。*2：使用ThermalCyclerDiceRealTimeSystemII（CodeNo.TP900）时，建议使用SYBR®PremixExTaqII(TliRNaseHPlus)(CodeNo.RR820A)。*3：SmartCycler®isaregisteredtrademarkofCepheidCorporation●试剂盒原理本制品使用了TaKaRaExTaqHS进行PCR扩增，通过检测反应液中SYBR®GreenI的荧光强度，达到监控PCR产物扩增量的目的。本制品中的DNA聚合酶由于使用了TaKaRaExTaqHS，从而抑制在调制反应液等低温条件下由引物产生的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，大大提高PCR扩增灵敏度。嵌合荧光检测法通过PCR反应生成双链DNA，SYBR®GreenI与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。-1-Primer荧光物质2.引物退火Polymerase3.延伸反应1.热变性●制品内容（50μl反应×200次）SYBR®PremixExTaq（2×）（TliRNaseHPlus），Bulk*15mlROXReferenceDye（50×）*2200μl*1内含TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+，TliRNaseH，SYBR®GreenI等。*2使用在LifeTechnologies等公司的RealTimePCR扩增仪上，用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。ROXReferenceDye的用量取决于所用仪器，请遵循如下原则：◆使用如下仪器时，ROXReferenceDye(50×)添加量为PCR反应体系的1/50：StepOnePlus™Real-TimePCRSystem(LifeTechnologies)◆使用如下仪器时，ROXReferenceDye(50×)添加量为PCR反应体系的1/250：AppliedBiosystems7500/7500FastRealTimePCRSystem(LifeTechnologies)◆使用如下仪器时，不需要添加ROXReferenceDye(50×)：ThermalCyclerDiceRealTimeSystem（CodeNo.TP850/TP870）SmartCycler®IISystem（Cat.#SC200N/SC210N）LightCycler®/LightCycler®480System（RocheDiagnostics）CFX96Real-TimePCRDetectionSystem（Bio-Rad）●试剂盒外必备主要试剂和仪器RealtimePCR扩增仪（authorizedinstruments）qPCR实验专用的离心管或反应板PCR引物：引物设计请参考“附录”。灭菌蒸馏水微量移液器和枪头（高压灭菌）●保存：4℃可保存6个月。避光保存，避免污染。干冰运输，到货后4℃避光保存。长期保存请置于-80℃，勿存于-20℃。产品融解后请于4℃保存，并在6个月内用完。●使用注意以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。1．使用前，请上下轻轻颠倒混匀，避免产生气泡，防止因混合不均匀造成的反应效果不佳。(1)请勿涡旋振荡混匀。(2)SYBR®PremixExTaq（2×）（TliRNaseHPlus），Bulk在-80℃存放可能会产生白色或淡黄色的沉淀，可用手握缓慢溶解，于室温短时间避光放置，轻柔上下颠倒混匀直至沉淀全部消失。(3)沉淀会导致溶液成分不均匀，使用前务必充分混匀试剂。2．配制反应液时，试剂请于冰上放置。3．本制品中含有荧光染料SYBR®GreenI，配制PCR反应液时应避免强光照射。4．反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，尽量避免污染。5．本制品中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。-2-●操作方法◆应用ThermalCyclerDiceRealTimeSystem扩增仪的操作方法1.按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaq（2×）（TliRNaseHPlus），Bulk12.5μl1×PCRForwardPrimer（10μM）0.5μl0.2μM*1PCRReversePrimer（10μM）0.5μl0.2μM*1DNA模板（100ng）*22μldH2O（灭菌蒸馏水）9.5μlTotal25μl*3*1通常引物终浓度为0.2μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0μM范围内调整引物浓度。*2DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。另外，2StepRT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。*3建议反应液体积为25μl。2.进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。两步法PCR扩增标准程序：Hold（预变性）Cycle：195℃30sec.2StepPCR*4Cycle：4095℃5sec.60℃30sec.Dissociation*4：最适的PCR条件，请参考“实验条件的选择”。3.实验结果分析。反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。◆应用AppliedBiosystems7500/7500FastReal-TimePCRSystem或StepOnePlus™Real-TimePCRSystem的操作方法*请按照LifeTechnologies各种仪器使用说明书要求进行实验操作。1.按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。使用StepOnePlus™Real-TimePCRSystem时，ROXReferenceDye(50×)添加量为PCR反应体系的1/50。-3-试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaq（2×）（TliRNaseHPlus），Bulk10μl1×PCRForwardPrimer（10μM）0.4μl0.2μM*1PCRReversePrimer（10μM）0.4μl0.2μM*1ROXReferenceDye（50×）0.4μl1×DNA模板（100ng）*22μldH2O（灭菌蒸馏水）6.8μlTotal20μl*3使用AppliedBiosystems7500/7500FastReal-TimePCRSystem时，ROXReferenceDye(50×添加量为PCR反应体系的1/250。试剂使用量使用量终浓度SYBR®PremixExTaq（2×）（TliRNaseHPlus），Bulk10μl25μl1×PCRForwardPrimer（10μM）0.4μl1μl0.2μM*1PCRReversePrimer（10μM）0.4μl1μl0.2μM*1ROXReferenceDye（50×）0.08μl0.2μl0.2×DNA模板（100ng）*22μl4μldH2O（灭菌蒸馏水）7.12μl18.8μlTotal20μl*350μl*3*1通常引物终浓度为0.2μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0μM范围内调整引物浓度。*2在20μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。如果欲使用本制品进行2StepRT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。*3按照各仪器推荐体系进行反应液配制。2.进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。StepOnePlus™Real-TimePCRSystem两步法PCR扩增标准程序：HoldingStageStep1:95℃30sec.CyclingStageNumberofCycles:40Step1:95℃5sec.Step2:60℃30sec.MeltCurveStage-4-AppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystem两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性NumberofCycle：195℃30sec.Stage2：PCR反应NumberofCycles：4095℃5sec.60℃34sec.Stage3:MeltCurveAppliedBiosystems7500Fast