10刘学军-透析液体的微生物检测与质量控制(云南)

透析液体的微生物监测与质量控制卫计委中日友好医院刘学军透析用水:用于血液透析治疗满足微生物和化学污染物要求的水。包括透析液的制备,透析器复用,浓缩液制备和在线对流治疗的置换液制备。透析浓缩液:包括含有各种离子的酸性浓缩液和含有碳酸氢盐的浓缩液,两者混合并且被透析用水稀释成特定浓度的透析液用于透析治疗。透析液:包含离子、缓冲液和葡萄糖的水溶液。用于透析过程中的溶质交换超纯透析液(UPD):用于在透析中可能发生对流的高纯度透析液在线生成的置换液:在血液透析滤过和血液滤过治疗中可以输入人体或进行血液回路预冲的液体什么是透析液体？血液透析原理0,5l/min=120L/4h透析液进0,2l/min=48L/4h血液透析液出+滤出液血液:48L透析液:120L(4个小时)Addaptedfrom:JörgVienken(2013)血液透析器透析器超滤系数与分子量的关系Urea(60)分子量DaCrea(113)iP(96)1005005,00010,00020,00050,000100,000小分子物质中分子量物质大小示意图中・大分子量物质β2-MG(11,800)α1-MG(33,000)Alb(68,000)血液透析清除物质的分子量瘦素(16,000)51560低通量中通量高通量微生物与透析膜孔径细菌病毒酵母内毒素肽聚糖透析膜最大孔径内毒素的种类肽聚糖，革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的构成分子；由糖组成。与氨基酸桥键交联；诱导细胞因子LipidA脂质A，内毒素中毒性最大的成分胞壁酰二肽，构成细菌细胞壁的小分子；IL-1生成的有效刺激因子外毒素，由细菌产生并释放到细菌外的毒素；其中具有人类已知的毒性最大的物质其它，仍待进一步研究内毒素，又称为脂多糖，LPS。致热性、热稳定分子，源于革兰氏阴性菌细胞外壁；复杂的脂肪和糖的复合物各种内毒素的分子量分子量Da1005005,00010,00020,00050,000100,000大小示意图内毒素可以通过透析膜51560脂质A相关LPS片段（2000～4000）胞壁酰二肽（400～1000）内毒素A片段（5000）其他LPS片段（8000）肽聚糖（1000～20000）其它外毒素（20000～50000）低通量中通量高通量From:BoccatoC.,EvansD.,LucenaR.,VienkenJ.WaterandDialysisFluids–aqualitymanagementguide(2015)Endotoxinsstimulatemacrophagestoproducethreegroupsofpowerfulmediators:proteins,reactiveoxygenspecies(oxygenradicals)andlipids.内毒素刺激巨噬细胞产生三组功能强大的炎症介质：蛋白，活性氧片段（氧自由基）和脂类。BiologicalactionofEndotoxins内毒素生物活性细胞因子脂类活性氧片段（氧自由基）前列腺素E2血栓素A2血小板活化因子肿瘤坏死因子白介素-1白介素-6白介素-8氧过氧化氢氮氧化物炎性介质合成扩大炎性介质合成抑制炎性介质水平低炎性介质产生过量有益影响轻微发热免疫系统的全身刺激杀灭微生物有害影响高热休克低血压弥漫性凝血慢性炎症过程巨噬细胞内毒素短期影响长期影响热源反应(MilesAM,FriedmanEA,1996)免疫缺陷(Descamps-LatschaB,HerbelinA,1993)B2-微球蛋白相关淀粉样变(Descamps-LatschaB,HerbelinA,1993;BerlandYetal.,1995)对促红细胞生成素抵抗(BaranyP,etal.,1997)动脉粥样硬化(RidkerPMetal.,1997;HaverkateFetal.,1997)分解代谢(PereiraBJG,1995)Generalarchitectureofendotoxinsandlipid-AfromGram-negativebacteria透析液微生物污染的临床结果肽聚糖脂多糖LipidA脂质A外膜内膜内毒素由革兰阴性细菌产生类脂质A（2000da）内毒素由革兰阴性细菌产生脂多糖脂低聚糖From:BoccatoC.,EvansD.,LucenaR.,VienkenJ.WaterandDialysisFluids–aqualitymanagementguide(2015)内毒素由革兰阴性细菌产生Releasedinlowquantitiesduringgrowth在细菌生长过程中有少量释放Releasedinhighquantitieswhencellularlysesoccur在细胞溶解时会大量释放细菌和内毒素是透析治疗应该重点关注的微生物，它是影响透析质量的最关键因素From:BoccatoC.,EvansD.,LucenaR.,VienkenJ.WaterandDialysisFluids–aqualitymanagementguide(2015)ISO23500:2014ISO11663:2014ISO13958:2014ISO13959:2014ISO26722:2014与血液透析相关的国际标准血液透析及相关治疗用透析液质量血液透析及相关治疗用浓缩液血液透析及相关治疗用水血液透析及相关治疗用水处理设备血液透析及相关治疗用液体制备指南在线生成的置换液设备检测指南家庭和急诊透析验证对微生物的严格要求From:BoccatoC.,EvansD.,LucenaR.,VienkenJ.WaterandDialysisFluids–aqualitymanagementguide(2015)ISO23500:2014ISO11663:2014ISO13958:2014ISO13959:2014ISO26722:2014与血液透析相关的国家标准血液透析及相关治疗用透析液质量血液透析及相关治疗用浓缩液血液透析及相关治疗用水血液透析及相关治疗用水处理设备血液透析及相关治疗用液体制备指南在线生成的置换液设备检测指南家庭和急诊透析验证对微生物的严格要求已经报批YY0598:2015YY0572:2015YY0791.1:2010From:BoccatoC.,EvansD.,LucenaR.,VienkenJ.WaterandDialysisFluids–aqualitymanagementguide(2015)Online-preparedsubstitutionfluidshallbesterileandnonpyrogenicandmaybeproducedonlinebyaprocessofultrafiltrationwithendotoxin-retentivefilters.Thisonlineprocessshallbevalidatedbythemanufacturertoproducesubstitutionfluidthatissterileandnonpyrogenic.ISO标准-微生物污染要求透析用水超纯透析液标准透析液在线生成的置换液应该无菌、无热源，经过内毒素截留过滤器通过超滤方式生成。这种在线的过程应由制造商负责验证其生成的置换液无菌、无热源。透析液体的监测与质量控制1.使用正确的微生物检测方法2.对透析设备进行有效的消毒3.透析设备上安装内毒素过滤器4.透析液的正确使用《关于批准发布YY0572-2015《血液透析及相关治疗用水》等90项医疗器械行业标准的公告（2015年第8号）》：YY0572-2015《血液透析及相关治疗用水》等90项医疗器械行业标准已经审定通过，现予以公布。国家食品药品监督管理总局2015年3月2日透析用水新标准透析用水新标准（微生物要求）透析用水中的细菌总数应不超过100CFU/mL，干预水平应建立在系统微生物动力学知识之上。通常，干预水平是最大允许水平的50%。透析用水中的内毒素含量应不超过0.25EU/mL。必须建立干预水平，通常，是最大允许水平的50%。透析用水新标准（微生物检测）1.应在透析装置和供水回路的连接处收集试样，取样点应在供水回路的末端或在混合室的入口处。2.试样应在收集后4h内进行检测，或立即冷藏，并在收集后24h内检测，应采用常规的微生物检测方法（倾注平板法、涂布平板法、薄膜过滤法）获得细菌总数（标准培养皿计数），薄膜过滤法是首选的检测方法，但不接受接种环法。3.培养基宜选用胰化蛋白胨葡萄糖培养基（TGEA）、R2A营养琼脂培养基（R2A）或其他确认能提供相同结果的培养基，不能使用血琼脂培养基和巧克力琼脂培养基，推荐使用17℃～23℃的培养温度和168h（7d）的培养时间，确认能提供相同培养结果的其他培养时间和培养温度也适用。没有方法可以给出微生物总数。供水回路的末端透析装置与供水回路的连接处采样点混合室的入口处透析用水新标准（取样点）供水回路的末端20CFU/100mL=0.2CFU/mL透析装置与供水回路的连接处260CFU/100mL=2.6CFU/mL透析用水新标准（取样点）薄膜过滤法透析用水新标准（检测方法）薄膜过滤法透析用水新标准（检测方法）薄膜过滤法透析用水新标准（检测方法）透析用水新标准（培养方法）培养基TGEA或R2A是合适水生细菌的寡培养基培养温度17-23°C的低温很重要，过高的培养温度会抑制微生物生长培养时间7天的培养时间目的在于使生长缓慢的微生物能够形成可视的菌落透析液体的质量控制1.对透析设备进行有效的消毒2.透析设备上安装内毒素过滤器3.透析液的正确使用•透析设备要有预防性消毒的理念•血液透析机使用后要清洗和消毒•反渗膜和反渗水输送系统定期消毒•B浓缩液和集中供液系统需频繁消毒•A浓缩液和集中供液系统不需要消毒透析设备消毒消毒频率决定系统的细菌含量预防性消毒对透析设备进行预防性消毒，目的是不给细菌繁殖的机会，杜绝生物膜的产生。每天透析机消毒和高频率的水处理系统消毒都属于预防性消毒。特别是热水消毒的水处理系统，可以实现每天消毒，为预防细菌滋生和产生生物膜提供了保证。预防性消毒•Planktonic(freelysuspendedcells)•浮游生物（自由悬浮的细胞）•Biofilm(sessilebacterialcells)•生物膜（固着的细菌细胞）生物膜1.CFU2.表面附着3.繁殖4.形成保护性多糖粘膜5.扩散易于生物灭活对抗生物灭活生物膜50freestreamflow100speed=10-20m/sCourtesyofG-J.TuschewitzkiAddaptedfrom:JörgVienken(2009)即使经过消毒生物膜依然存在37足球比赛:球场中可以见到的有22球员,但有50000观众在球场看台看球赛......CFU透析液水管内壁细菌在管路中的存在状况细菌检测CFU消毒剂水管内壁消毒是杀灭管路上的细菌管道消毒:杀灭管道上刚刚附着还没有形成生物膜的细菌CFU消毒剂水管内壁消毒是杀灭管路上的细菌管道消毒:杀灭管道上刚刚附着还没有形成生物膜的细菌自来水在经过活性炭过滤器之后，作为杀菌剂的氯被清除掉了，虽然反渗膜理论上可以阻挡细菌的通过但并不能清除细菌。如果不采取手段杀灭细菌，它们会附着在反渗膜和纯水管道上。为了防止细菌附着后形成生物膜和释放内毒素，必须频繁的对水处理系统进行消毒。特别是反渗水管道，对微生物学的要求非常高，否则会对新产生的反渗水造成二次污染。水处理系统消毒的主要目的如果使用含有微生物的透析液，微生物会附着在管道上。消毒就是杀灭这些附着在透析管道上的微生物，减少透析相关并发症的发生，保证透析病人的透析质量和生存质量。血液透析机消毒程序的设置是为了更有效的杀灭这些附着在管道上微生物。消毒=刷锅透析机消毒的主要目的水处理系统：热水消毒，化学消毒，紫外线消毒，臭氧消毒血液透析机：热化学消毒，冷化学消毒，热水消毒透析设备消毒•通过氧化菌体的蛋白质来实现消毒的目的•通过强穿透力的热水潜能使蛋白质变性或者凝固•通过