现代分子生物学课件-第六章

第六章分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术本章主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技术和方法，比如通过这些方法研究：（1）单个或多个基因在生物体的某些特定发育阶段或在不同环境下的表达模式；（2）某基因缺失后生物体表型变化分析该基因功能；（3）蛋白质相互作用认识信号转导通路等。6.1.1基因表达系列分析技术基因表达系列分析技术（SAGE）是一种以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术。SAGE的操作过程如下图或书中图6-1所示。6.1基因表达研究技术生物素酰化的Oligo-dT引导合成cDNA双链AAAAAATTTTTT锚定酶（设为Nla)酶切，磁珠吸附AAAAAATTTTTTAAAAAATTTTTTAAAAAATTTTTTCATGGTACCATGGTACCATGGTACCATGGTACCATGGTACCATGGTACCATGGTACCATGGTACCATGGTACCATGGTAC计算机数据分析克隆，测序连接，形成多联体PCR扩增，锚定酶酶切BAABBA平端连接标签酶酶切，释放标签，末端补平分成两池，加入接头A，BmRNARNA选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接体的过程。选择性剪接一般分为：平衡剪接，5’选择性剪接，3’选项择性剪接，外显子遗漏和相互排斥性剪接。如6-2。发现新的可变剪接体（splicevariant），确定每个异构体（isoform）的独特功能和生物学意义并阐明其调节机制，是功能基因组时代的一个重要特征。6.1.2RNA的选择性剪接技术BTLA剪接体基因的结构分析RT-PCR法克隆人BTLA编码区基因电泳结果BTLAs（BTLAsplicevariant）BTLAs编码的异构体蛋白BTLAi序列分析及其预测异构体BTLAi（BTLAisoform）的氨基酸序列比对及其结构分析BTLAi和BTLA跨膜预测A:BTLAi;B:BTLABTLA和BTLAi的跨膜螺旋段预测结果融合蛋白BTLAs-DsRed2和BTLAs-DsRed2的在转染细胞膜上表达的检测图3.5流式细胞术检测HVEM-Fc融合蛋白和单抗MIH26与基因转染细胞结合的结果激光共聚焦观察DsRed2和GFP在转染细胞的分布原位杂交是用标记的核酸探针，经过放射自显影或放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量的一种方法。RNA原位杂交：在mRNA水平上，用标记的探针与固定的组织切片反应后进行显色反应，从而对该基因的表达进行定性定量分析。6.1.3原位杂交技术荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术。FISH的基本原理是首先对寡核苷酸探针进行特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。荧光原位杂交（FISH）基因定点突变技术常用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列，修饰表达载体，引入新的酶切位点等。主要采用PCR法：重叠延伸技术和大引物诱变法。6.1.4基因定点突变技术6.2.1基本原理*经典遗传学：从表型出发，研究基因型。*现代遗传学：从基因序列出发，推测表型，从而推导出该基因功能。基因敲除：又称为基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。6.2基因敲除技术完全基因敲除：通过同源重组法完全消除细胞或动物个体中的靶基因活性。一般采用取代型或插入型载体在ES细胞中根据正负双向选择原理进行完全基因敲除。图6-9；图6-10。1、完全基因敲除条件型基因敲除：通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。对有重要生理功能的基因，完全基因敲除使有关基因功能的研究无法开展。Cre/LoxP和FLP/FRT系统，具有可调节性。图6-11。2、条件型基因敲除图6-11条件型基因敲除策略图6-12基因敲除的主要技术策略与步骤6.3.1酵母单杂交系统(yeastone-hybridsystem)20世纪90年代发展，用于研究蛋白质—DNA相互作用。在酵母细胞内研究真核生物DNA—蛋白质相互作用，并通过DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。6.3蛋白质及RNA相互作用技术用途：研究DNA-蛋白质之间的相互作用，筛选转录调控因子。特点：可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，通过筛选DNA文库，直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。原理：将已知的特定顺式作用元件构建到带有报告基因最基本启动子(pmin)的上游，然后编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域(AD)融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。图6-15酵母单杂交的基因原理示意图图6-16从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图酵母双杂技术主要用于研究蛋白质之间的相互作用。酵母双杂系统利用了真核生物转录调控因子的组件式结构特征：DNA结合结构域；转录激活结构域。酵母双杂原理示意图：图6-17。6.3.2酵母双杂交系统方法：通过从文库中选择或筛选与靶蛋白相互作用的新蛋白来实现真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA结合域（BD），其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般情况下，BD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段（UAS）相结合，AD则推动了转录起始。图6-17酵母双杂交技术原理示意图1、FarWestern印迹技术2、GST融合蛋白沉淀技术3、蛋白质芯片技术4、等离子表面共振技术5、免疫共沉淀技术6.3.3体外蛋白质相互作用技术将蛋白质标上荧光探针，当蛋白质间不发生相互作用时，其相对距离较大，无荧光共振能量转移（FRET）现象；而蛋白质发生相互作用时，其相对距离缩小，FRET发生(图6-23)。6.3.4细胞内蛋白质相互作用技术——FRET技术RNAi（RNAinterference，RNA干扰）技术：利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因的表达，使细胞胞出现靶基因缺失的表型。dsRNA：双链RNA；siRNA：shortinterferingRNA，小分子干扰RNA。RNAi作用机制示意图：图6－24。6.3.5RNAi技术及其应用图6-24RNAi作用机制图解基因芯片（genechip）或又称为DNA微列阵（DNAmicroarray）技术：能够同时监测大量靶基因表达的实验手段，迅速准确地在基因组水平上阐棕不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。6.4基因芯片及数据分析用机械手把已知或未知的DNA片段点到玻片或其它载体上并使之固定，用不同细胞周期发育阶段的cDNA作探针系统性地研究细胞中任何时期特异表达的基因。若把某一生物体内全部基因分别点到DNA微列阵或者基因芯片上，再用不同发育阶段的cDNA与之杂交，就能了解某些基因对特定生长发育阶段的重要性。基因芯片还可用于进行基因诊断。先建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图，用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，检哪些基因的表达受抑制或激活。凝胶滞缓实验（EMSA）：是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。基本原理是蛋白质与DNA结合后将大增加相对分子质量，没有结合蛋白的DNA片段跑得快，而与蛋白质形成复合物的DNA由于受到阻滞而跑得慢。6.6其它分子生物学技术噬菌体展示技术：是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。因而可用于筛选目的蛋白。图6-36图6-36噬箘体展示技术研究蛋白质相互作用蛋白质磷酸化技术底物蛋白磷酸化和蛋白激酶活性检测蛋白质分离、SDS-PAGE、体外磷酸化反应（图6-38）图6-38蛋白激酶体外磷酸化活性分析