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细胞凋亡Apoptosis主要内容概述细胞凋亡的形态学变化和生化改变细胞凋亡的过程与调控细胞凋亡的发生机制细胞凋亡在疾病防治中的意义细胞凋亡(科普诗)似秋叶的凋零,告别生命之辉煌;那难以计数的攻击、诱导,轻启着道道程序,逼细胞步步走向生命的末端;啊,活性氧处处肆虐,钙波涛惊石裂岸,线粒体把生命之光一点一点拧淡;危难中的细胞啊,你沉稳不乱,DNA片片切割,化云梯直通天堂;细胞体分团相聚,把生命的凝重浓集在小体上;分别了朝夕相处的伙伴,再见了快乐美好的时光;这一切的一切又融入临近的胞体,腾出的空间再写生命的篇章。2001,10,1试作一、概述•细胞凋亡(apoptosis),是1972年由Kerr等建议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的变化形式的。•“凋亡”一词来自希腊语,apo意为“分离”,ptosis指花瓣或树叶的脱落,•“凋亡”是由这两个词组合而成,意指细胞凋亡的形态类似秋天花瓣或树叶的凋落一样(一)细胞凋亡研究简史1.凋亡概念的形成2.细胞凋亡的形态学及生物化学研究阶段:(1972-1987)1977年:人们注意到在生理或病理性刺激条件下,淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。1980年:Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化,总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征,包括核固缩和DNA降解成寡核苷酸片段等3.细胞凋亡的分子生物学研究阶段,最近几年1989年:0wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中证明了信号传递物质对PCD的调控作用。1991年:Ellis首先发现了线虫(C.elegans)体内Ced-3、4两个基因与PCD的发生密切相关,随后逐渐发现了多种参与PCD的正相调节基因和负相调节基因4.细胞凋亡的临床应用基础研究阶段细胞凋亡的研究,其生命力在于最终能够有利于疾病机制的阐明,以及新疗法的探索及问世。2002年10月7日英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿,因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。他们不但发现在生物的器官发育过程中存在细胞程序性死亡,而且阐明了细胞程序性死亡过程中的基因规律。SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnE.SulstonTHENOBELDIPlOMA2002年诺贝尔医学与生理学颁奖仪式,瑞典斯德哥尔摩音乐厅。SydneyBrennerreceivinghisNobelPrizefromHisMajestytheKingattheStockholmConcertHall.Photo:HansMehlin,Nobele-Museum(二)细胞死亡的方式细胞坏死细胞凋亡细胞程序性死亡1.细胞坏死(necrosis)是细胞受到急性强力伤害时立即出现的反应早期表现为细胞膜破坏,线粒体肿胀溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起炎症坏死坏死炎细胞浸润•细胞凋亡的概念:由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程•细胞凋亡的特点:①细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体;②凋亡小体内有结构完整的细胞器;③溶酶体活性不增加④内切酶活化,DNA片断化,凝胶电泳图谱呈梯状2.细胞凋亡(apoptosis)凋亡3.细胞程序性死亡细胞程序性死亡(programmedcelldeath,PCD)是一种基因指导的细胞自我消亡方式。PCD和细胞凋亡的区别在以下方面:PCD是功能性概念,凋亡是形态学概念。大多数PCD的最终结果是细胞凋亡,但细胞凋亡并非都是程序化的。PCD存在于胚胎发育过程中。细胞凋亡与细胞坏死的比较(一)坏死凋亡1.性质病理性,非特异性生理性/病理性,特异性2.诱因强烈刺激,随机发生较弱刺激,非随机发生3.基因调控无有4.生化特点被动过程无新蛋白合成不耗能主动过程有新蛋白合成耗能细胞凋亡与细胞坏死的比较(二)坏死凋亡5.形态改变细胞肿胀结构溶解,破坏细胞皱缩,核固缩胞膜/细胞器相对完整6.凋亡小体无有7.DNA变化弥散性降解电泳呈均一片状片段化(180-200bp)电泳呈“梯”状条带8.溶酶体改变破裂相对完整9.炎症反应局部炎症反应局部无炎症反应细胞凋亡的特征是细胞由于降解酶,主要是水解酶(蛋白酶与核酸酶)的作用,在近乎正常的细胞质膜内趋向死亡。这与坏死时细胞质膜早期破损不同。在细胞凋亡过程中,质膜脂双层丧失二侧不对称性,磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面,从而导致被吞噬。(三)线虫(C.elegant)中的细胞程序性死亡隐杆秀丽线虫(Caenorhabditiselegans,Celegans)低等蠕虫,虫体透明,易于观察体内细胞形态的变化。线虫:成体959个细胞,但在发育过程中有131个细胞会注定发生PCDPCD发生时间:1h左右参与线虫PCD的基因,目前已知的有14个经典凋亡模型Apoptosisisallaroundus(四)生理性细胞凋亡的作用1.确保正常发育、生长在器官、组织的形成、成熟中发挥作用(细胞团具备复杂结构的组织器官)多余细胞的清除生理性细胞凋亡的作用2.维持内环境的稳定清除受损、衰老和突变的细胞(针对自身抗原T细胞的清除、子宫内膜周期性剥脱)3.发挥积极的防御作用病毒DNA二、细胞凋亡的形态学变化和生化改变微绒毛消失脱水空泡化(blebbing)固缩(condensation)出芽(budding)染色质边集(margination)凋亡小体(apoptosisbody)(一)细胞凋亡的形态学变化细胞首先变圆,随即与邻周细胞脱离,失去微绒毛,胞浆浓缩,内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合,核染色质密度增高呈半月形,并凝聚在核膜周边,核仁裂解,进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个外有膜包裹、内涵物不外泄的细胞凋亡小体,被吞噬细胞或邻周细胞所识别、吞噬,或自然脱落而离开生物。不引起炎症反应和次级损伤。apoptosis凋亡时细胞的形态学改变凋亡过程与调控空泡化固缩出芽边集凋亡小体形态学特征:染色质边集胸腺细胞正常凋亡AcomparisonofnormalandapoptoticT-cells.胸腺细胞正常凋亡(二)细胞凋亡的生化改变DNA片断化caspase激活灭活凋亡抑制物水解活性蛋白水解结构蛋白Ca2+/Mg2+Zn2+核酸内切酶激活①②③1.DNA的片段化:梯状条带形成核小体连接区被切开:染色质300kb50kb180~200bp或其整倍数片段5min90min2.内源性核酸内切酶激活及其作用由一系列胞内信号转导环节激活,执行染色质DNA切割3.凋亡蛋白酶(caspases)的激活及其作用是一组对底物天冬氨酸部位有特异水解作用,其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶(cysteine-containingaspartate-spicificprotease)至少有13个成员第一个被发现的caspase是caspase-1,即哺乳类的ICE(1992,1993),后来证明ICE与炎症有关而在细胞的死亡中没有明显作用。线虫的CDE-3和ICE有一定的同源性。Caspase8的激活,需要FADD(Fasassociatedproteinwithdeathdomain)Caspase9激活,需要通过CARD(caspase-recruitmentdomain)、Apaf-1、细胞色素c、ATP等多个因子的参与。细胞色素C、Apaf-1和pro-caspase9组成了“Apoptosome”(凋亡体)caspases功能①灭活细胞凋亡的抑制物:正常活细胞因为核酸酶处于无活性状态,而不出现DNA断裂。这是由于核酸酶和抑制物结合在一起,如果抑制物被破坏,核酸酶被激活,DNA就会被降解,片段化。现知Caspase可以裂解这种抑制物。②水解蛋白质结构,细胞解体,形成凋亡小体如裂解核纤层,核纤层是由核纤层蛋白通过聚合作用形成的头尾相接的多聚体,由此形成核膜的骨架结构,是染色质得以形成并进行正常的排列。细胞凋亡时,核纤层蛋白被Caspase在一个近中部的固定位置裂解,从而使Caspase蛋白崩解,导致染色质的固缩。③在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白:使其获得或丧失功能如灭活或下调DNA修复有关的酶,mRNA剪切蛋白等。三、细胞凋亡过程与调控(一)细胞凋亡的过程cAMPCa2+神经酰胺凋亡诱因凋亡信号转导凋亡基因激活细胞凋亡凋亡细胞清除受体死亡信号DNase活化Caspases活化↓∶DNA片断↓凋亡小体形成巨噬细胞吞噬、分解apoptosis凋亡过程与调控凋亡过程Ⅰ受体cAMPCa2+神经酰胺凋亡相关基因激活信号转导细胞膜细胞核凋亡诱导因素+Dnase激活Caspases激活死亡信号apoptosis凋亡过程与调控凋亡过程ⅡDNase激活Caspases激活凋亡细胞的清除凋亡执行(二)细胞凋亡的调控1.细胞凋亡相关因素诱导性因素激素和生长因子失衡理化因素免疫性因素微生物学因素大量糖皮质激素↓淋巴细胞凋亡射线/高温/强酸/强碱/乙醇/抗癌药物CTL分泌粒酶HIV→CD4+细胞凋亡抑制性因素细胞因子(IL-2/NGF)激素(ACTH/睾丸酮/雌激素)金属阳离子(Zn2+)药物(苯巴比妥/半胱氨酸酶抑制剂)病毒EB病毒/牛痘病毒凋亡信号转导系统特点①多样性:不同种类的细胞系统不同②偶联性:与增殖分化的信号系统交叉偶联③同一性:多因素,共用同一系统触发④多途性:同一诱导因素启动多条信号转导途径2.细胞凋亡信号的转导APOPTOSIS腺苷酸环化酶←钙调素←Ca2+↓↓cAMP↑谷氨酰胺转移酶↓↓PKA↑转录因子神经酰胺↓SPP↑↓AP-1↑↓S期(抗凋)caspase↑↓H1组蛋白MAPK↑MAPKK↑Raf-1↑Ras↑PTK↑↓分化×PKC↑二酰甘油糖皮质激素①②③④⑤⑥研究较多的系统:依据:①细胞凋亡时胞内游离Ca2+浓度显著上升②用Ca2+载体A23187人为升高B淋巴细胞Ca2+水平,B淋巴细胞凋亡③用Ca2+络合剂降低胞内Ca2+水平,阻止细胞凋亡1.胞内Ca2+信号系统(Ca2+为第二信使)激活Ca2+依赖谷氨酰胺转移酶Ca2+↑活化转录因子2.cAMP/PKA信号系统(cAMP为第二信使)依据:①双丁酰cAMP可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞凋亡②糖皮质激素使cAMP上升cAMP↑→激活PKA→使靶蛋白某些氨基酸(苏、丝AA)残基磷酸化→改变蛋白质功能3.Fas蛋白/Fas配体信号系统Fas蛋白:细胞膜跨膜蛋白Fas蛋白+Fas配体(抗Fas)→细胞凋亡机制:①Fas蛋白+Fas配体(抗Fas)→神经鞘磷脂酶活性↑→产生神经酰胺→蛋白激酶激活→细胞凋亡②Fas蛋白+抗Fas、TNF→激活ICE样caspase→降解H1组蛋白→染色体松驰→DNA暴露内切酶位点③通过Ca2+信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡Fas又称CD95,APO-1,是由325个氨基酸组成的受体分子配体诱导受体三聚体化,然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物,Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域(DD,deathdomain)。死亡结构域相聚成簇,吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白,它由两部分组成:C端(DD结构域)和N端(DED)部分。FADDN端通过DED区(deatheffectordomain)与无活性的半胱氨酸蛋白酶8(caspase8)酶原结合,激活Caspase-8。进而引起随后的级联反应,即Caspases,Caspase-8自剪切活化,激活Caspase-3,Caspase-7Caspase-3激活Caspase-6。Caspase可降解结构蛋白、信号蛋白、转录调控蛋白、周期蛋白等等。Caspase还可降解CAD的调节蛋白,释放出CAD,CAD进入细胞核降解DNA。CAD为caspase-activatedDnase,存在于胞质中。死亡受体属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族
本文标题:分子生物学-6细胞凋亡
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