β-内酰胺酶的分类及检测

β-内酰胺酶的分类及检测医院检验医学中心表2β-内酰胺酶的结构和功能分类分子结构功能举例最适底物抑制剂(Ambler)(Bush)PENCARBOXCRCTXATMIPMCLAVCLOXEDTA丝氨酸酶A2aPC1，LEN-1卅十－土－－－卄－－2bSHV-1,TEM-1卅十十卄－－－卄－－2beK1,TEM-3,卅十十卄卄卄－卄－－SHV-2,PER-12brTEM-31卅十十十－－－－－－2CPSE-1,BRO-1卄卅十十－－－十－－2e卄卄－卄卄卄－卄－－2fSme-1,NMC-A卄十?十十卄卄十－－IMI-1C1AmpC卄十－卅十－－－卄－D2dOXA-1卄十卅十－－－V－－未定4AVS-1卄卄卄VV－－－－－金属酶B3IMP-1卄卄卄卄卄－卄－－卄嗜麦芽L-1•Bush-J-M分类策略•3组金属酶•头孢菌素酶1组•酶EDTA2e组•2a组•2d组•青霉素酶2c组•2f组•非金属酶4组•2be组•广谱酶2b•2br组小结1组酶：头孢菌酶，优先水解底物是头孢菌素，它们水解青霉素的的速率低于水解头孢噻啶的速率的30%，对三代头孢菌素和头霉烯耐药，但对碳青酶烯和四代头孢菌素较为敏感，对酶抑制剂克拉维酸和EDTA均不敏感，可被氯唑西林抑制2组酶：优先水解青霉素类抗生素，其中水解头孢噻啶的速率低于水解青霉素的速率的30%者为青霉素酶，又分为2a、2b、2c、2d、2e和2f亚组。3组酶：又称金属酶，能灭活青霉素类、头孢菌素类和碳青酶烯类抗生素，但对安曲南敏感；酶活性可被EDTA抑制，但酶抑制剂克拉维酸和氯唑西林对它无作用。4组酶：是染色体介导的耐抑制剂的青霉素酶，对头孢类抗生素的敏感性不定，对氨曲南和碳青霉烯敏感。A类β-内酰胺酶1。A类β-内酰胺酶：广谱酶2b组ABA大肠埃希菌TEM-1型酶结构；B肺炎克雷伯菌的SHV-1型酶结构超广谱β-内酰胺酶(2be)经典超广谱β-内酰胺酶TEM型ESBLsSHV型ESBLsSHV-2型ESBLs、SHV-5型ESBLsSHVΩ环突变型ESBLs其他超广谱β-内酰胺酶CTX-M-型酶可为分4个小组PER-1及其相关ESBLPER-1、-2、VEB-1、2CME-1TLA-1特殊的非典型ESBLSFO-1、GES-1TEM型ESBLs1．Glu140→Lys和Glu240→Lys替换：对头孢他啶和氨曲南耐药2．Arg164→Ser或His：对头孢他啶耐药，对头孢噻肟敏感3．Gly238→Ser：主要提高了对头孢噻肟的水解能力（如TEM-19)SHV型ESBLs1.SHV-2型ESBLs：Gly238→Ser，主要提高水解头孢噻肟的能力2.SHV-5型ESBLs：同时具有Gly238→Ser和Glu240→Lys突变3.SHVΩ环突变型ESBLs：Asp179→Ala、ArgA类β-内酰胺酶与B类、C类和D类酶的同源性比较B类β-内酰胺酶又称金属β-内酰胺酶，Bush功能分类中属于3组酶，能灭活青霉素类、头孢菌素类和碳青酶烯类抗生素，但对安曲南敏感；酶活性可被EDTA抑制，但酶抑制剂克拉维酸和氯唑西林对它无作用。金属酶的功能亚分类：3a、3b、3c金属酶的分子生物学亚型分类:B1、B2、B3亚分类物学亚类酶的型别宿主发现国家发现时间分子量等电点3aB1CcrA3脆弱拟杆菌美国199426未测3aB1CcrA4脆弱拟杆菌美国199426未测3aB1CcrA脆弱拟杆菌美国1986265.23aB1PCM-1洋葱假单胞菌未知1994未测8.53aB1IMP-1铜绿假单胞菌日本1991289.03aB1IMP-2不动杆菌属意大利1999268.13aB1IMP-3铜绿假单胞菌日本20003aB1IMP-4不动杆菌属香港20018.0杨氏枸橼酸杆菌中国2001未测未测3aB1IMP-6粘质沙雷菌日本2001未测未测3aB1IMP-7铜绿假单胞菌加拿大20023aB1IMP-8肺炎克雷伯菌中国台湾2001未测8.23aB1VIM-1铜绿假单胞菌意大利19995.33aB1VIM-2铜绿假单胞菌法国2000未测未测3aB1VIM-3铜绿假单胞菌台湾2000未测5.13bB2CphA嗜水气单胞菌意大利1993288.03bB2A2h嗜水气单胞菌美国1990288.03bB2ACP嗜水气单胞菌苏格兰1996318.23bB2AsbM1简达气单胞菌美国1990349.13bB2AsA-1杀蛙气单胞菌苏格兰1994197.93bB2Imis温和气单胞菌英国1995未测9.3cB2戈氏军团菌19862510.53aB3L1嗜麦芽窄食单胞菌日本19821186.9B类β-内酰胺酶金属酶的三维结构图A：CcrA（脆弱拟杆菌）B：BcⅡ（蜡样芽胞杆菌）C：L1（嗜麦芽窄食单胞菌）园柱代表α螺旋，板片代表β片层绿色数字为His残基，兰灰色数字为Asp残基，橙色数字为Cys或Ser残基。ABC获得性金属酶（1）IMP型金属酶（2）VIM型金属酶β-内酰胺酶的检测1．酶蛋白性质分析：包括表型分析和酶动力学分析。2．基因分析：基因型别分类、测序、分析其结构基因和调控基因。3．转移性分析：分析酶编码基因位于质粒上还是染色体上；在不在整合子中。收集菌株耐药表型分析（纸片药敏试验和E-试验分析）提取酶粗制品进行三相水解试验、等电聚焦电泳和酶动力学分析根据结果判定酶的类群，选择相应PCR引物扩增阳性阴性整合子PCR初筛阳性阴性鸟枪法克隆可表达β-内酰胺酶基因测定PCR产物序列PCR扩增全测定全克隆片段可变区并测序序列整合子检查提取质粒接合实验克隆并转化到DH5α表达β-内酰胺酶阳性阴性钙转或MgCl2或电转化•（2）耐药表型分析：纸片药敏试验和E-试验测定MICs•（3）酶性质分析：提取酶粗提物进行a.三相水解试验。b.等电聚焦电泳。C.酶动力学分析。•（4）基因分析：a.PCR扩增及PCR产物测序。b.PCR扩增整合子全可变区，分析其中结构和可能的β-内酰胺酶基因。•C.鸟枪法克隆可表达的β-内酰胺酶基因，分析基因结构。•（4）转移性分析：A。质粒：a.质粒接合试验。b.转化试验：电转化、钙转化或MgCl2转化•B。整合子：a.PCR扩增整合子全可变区及PCR产物序列测定。ESBLs和AmpCβ-内酰胺酶的检测一、ESBLs的检测1．纸片法：表1肺克、催娩克雷伯、大肠埃希菌ESBLs产株纸片法初筛和确证实验2．MIC法：表2肺克、催娩克雷伯、大肠埃希菌ESBLs产株MIC法初筛和确证实验验方法初筛试验表型确证试验培养基MHMH抗菌药物浓度头孢泊肟10μg或头孢他啶30μg头孢他啶30μg或头孢他啶/克拉维酸30/10μg氨曲南30μg或和头孢噻肟30μg或头孢噻肟30μg头孢曲松30μg头孢噻肟/克拉维酸30/10μg（同时用多于一种抗生素可提高试验灵敏度）（确证试验要求同时做上述四种纸片）孵育条件同标准纸片扩散法同标准纸片扩散法结果头孢泊肟抑菌圈≤22mm有一种抗生素出现加有克拉维酸纸片抑菌圈≥头孢他啶抑菌圈≤22mm没有加克拉维酸纸片抑菌圈5mm=产ESBL氨曲南抑菌圈≤27mm头孢噻肟抑菌圈≤27mm头孢曲松抑菌圈≤25mm=可疑产ESBL质量控制阴性对照ATCC25922阴性对照ATCC25922加有克拉维酸（参考质控标准）≤没有加克拉维酸抑菌圈2mm阳性对照ATCC700603头孢泊肟抑菌圈9-16mm头孢他啶/克拉维酸抑菌圈头孢他啶抑菌圈10-18mm≥头孢他啶抑菌圈5mm氨曲南抑菌圈9-17mm头孢噻肟抑菌圈17-25mm头孢噻肟/克拉维酸抑菌圈头孢曲松抑菌圈16-24mm≥头孢噻肟抑菌圈3mm验方法初筛试验表型确证试验培养基CAMHBCAMHB抗菌药物浓度头孢泊肟1μg/mL或头孢他啶0.25-128μg/mL头孢他啶1μg/mL或头孢他啶/克拉维酸0.25/4-128/4μg氨曲南1μg/mL或和头孢噻肟1μg/mL或头孢噻肟0.25-64μg/mL头孢曲松1μg/mL头孢噻肟/克拉维酸0.25/4-64/4μg（同时用多于一种抗生素（确证试验要求同时做上述可提高试验灵敏度）四种纸片）孵育条件同标准MIC法同标准MIC法结果生长=可疑产ESBL有一种抗菌素生素出现加有克拉维酸（例：MIC≥2μg/mL）的MIC≥没有加克拉维酸的MIC3个对倍稀释度=产ESBL质量控制阴性对照ATCC25922=无生长阳性对照ATCC700603阳性对照ATCC700603头孢泊肟抑菌圈≥2μg/mL有一种抗菌素生素出现加有克拉维头孢他啶抑菌圈≥2μg/mL的MIC≥没有加克拉维酸的MIC3个对氨曲南抑菌圈≥2μg/mL倍稀释度头孢噻肟抑菌圈≥2μg/mL头孢曲松抑菌圈≥2μg/mL二、AmpCβ-内酰胺酶的检测1．初筛试验2．头孢西丁三相水解试验3．联合用克拉维酸和氯唑西林两种抑制平行试验AmpC酶的检测1．酶的提取冻融法超声波破碎法1个菌落1个菌落种入12ml大豆汤。35度震摇4-6h种入40ml大豆汤。35度震摇过夜4度40000rpm，离心20min，去上清液4度4000rpm，离心20分钟，去上清沉淀物-890度反复冻溶5次重悬在5mlpH7.0的.01MPBS中，加入1.5mlpH7.0的0.01MPBS，超声波破碎10秒，间隔15秒重复旋转混匀。10次4度12,000转rpm离心20分钟4度12,000rpm离心20分取上清，-20度保存备用取上清液，-20度保存备用1．测定方法0.5麦氏单位浓度的大肠杆菌ATCC25922涂在MH平皿上，中心贴头孢西丁纸片（30）切出3-4个不同方向的狭缝，钩出其中的琼脂每沟中加入待测菌的40的粗提物35度孵育过夜观察结果