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20(S)-原人参二醇的药学与生物活性研究进展王小峰王玉芹(上海中医药大学,上海,201203;上海中药创新研究中心,上海,201203)摘要:20(S)-原人参二醇是人参皂苷元中非常重要的一类,一直是国内外一个研究的热点,本文对其化学性质、制备工艺、剂型研究和药理活性等进行全面综述总结,期望都对今后20(S)-原人参二醇的开发利用提供一定依据。关键词:20(S)-原人参二醇;生物活性;肿瘤20(S)-原人参二醇[20(S)-protopanaxadiol,20(S)-PPD]从结构上属于达玛烷型四环三帖类人参皂苷元化合物,自从上世纪六十年代日本学者发现确定结构以来,它的药理活性一直得到学者们的广泛关注,尤为其抗肿瘤活性,明显强于其他几种人参皂苷及其皂苷元,其结构如下:分子式为C30H52O3,分子量为460.70,熔点197.5~198.5℃,比旋光为][15Dα=29.34°(C=1.0,CHCl3)在丙酮中为簇状结晶。在特定的条件下,20(S)-PPD的20位羟基可发生构型转变,生成20(R)-PPD;由于在人参皂苷中存在的原型为20位之后的碳以直连型结构连接,所以称为20(S)-原人参二醇,但在一定条件下20位的羟基与双键发生脱水环合形,可形成20(S)-人参二醇或者20(R)-人参二醇[1]。1制备工艺研究目前制备20(S)-PPD主要是以人参属的三七、西洋参皂苷或者绞股蓝属植物的提取物等为原料,通过酸、碱、酶、微生物等方法,在一定条件下使皂苷水解脱去糖链而得到相应的皂苷元。李绪文等[2]以西洋参叶总皂苷为原料,利用NaOH强制降解,以温度、时间、NaOH用量、溶剂甘油用量进行四因素三水平的正交试验,结果表明四种因素中NaOH的用量对于20(S)-PPD产率的影响最大。在最佳降解工艺时,NaOH的用量在第二个水平,可能的原因是在较少的NaOH用量条件下,皂苷水解不够完全,而在较多的NaOH的量下,水解生成的20(S)-PPD在如此强碱条件下发生了结构的改变。梁国兴等[3]首次在无溶剂条件下,将原料三七总皂苷与NaOH研磨充分混合,在150℃条件下反应6小时,再经柱层析得到20(S)-PPD,产率高达10%,纯化后的20(S)-PPD可达90%以上,该方法操作简单并节约了溶剂。但是固体的混合均匀度较液体会有很大差距,达到相同的反应程度,液体体系反应的时间上会不会明显缩短,还有待进一步研究。惠永正等[4]以人参属植物或者叶的总皂苷为原料,在有机溶剂条件下,进行氧化降解,反应物柱层析得到20(S)-PPD,该方法条件温和,产率较高,成本低廉,适合工业化生产。张春红等[5]以人参二醇组皂苷为原料,氢氧化钠碱水解制备20(S)-PPD,比较了不同的溶剂、反应时间、反应压力等条件对于产率的影响,来确定最佳制备条件,结果溶剂四种溶剂相比,以异戊醇的效果最佳;水解时间上,24h最好;压力方面,以正丁醇和异戊醇为溶剂时常压的得率高于加压。刘磊等[6]利用土壤中分离得到的一种真菌黑曲霉,该曲霉可表现出较强的活性将20(R,S)-Rg3的两个糖酶解得到20(R,S)-PPD。2制剂学研究在制剂学方面,由于20(S)-PPD的水溶性很差,直接口服生物利用率低,目前多围绕增加其溶解度或者生物利用度来进行相关制剂研究。结构上看20(S)-PPD只有一个双键,对20(S)-PPD的制剂进行含量测定时多采用紫外检测器在较低波长203nm波长下,流动相选用高比例甲醇水或者乙腈水,反相HPLC进行测定[7-9]金圣煊等[10]以20(S)-PPD、注射用油、乳化剂、冻干保护剂按一定比例搅拌混合均匀后在冷冻干燥制得冻干乳剂,经验证,在3个月内各个指标均优于普通的乳剂。该方法简便易行,增加了药物的稳定性,对于药物的生物利用度也有一定的提高;另外他们[11]还用一定的载体材料(羧甲基纤维素、聚乙二醇4000、环糊精等)与20(S)-PPD按比例混合后,以喷雾干燥或者冷冻干燥的方法制备分散剂,体外溶出度试验表明,该分散剂提高了药物的溶解度和溶出速度,适合于制备成胶囊、片剂等固体制剂。还有学者[12-13]采用薄膜超声法制备了20(S)-PPD的普通药质体、Brij-78修饰药质体、PEG修饰的药质体,来增加其生物利用度,通过温度、乙醇、酸碱和人工胃肠液等体外实验考察了药质体的稳定性,结果表明,该方法制备的20(S)-PPD在各种条件下制剂学性质稳定,非常适合于将20(S)-PPD的上述药质体开发为口服,甚至于缓释制剂。陈婧[14]等制备了20(S)-PPD的药质体、醇质体、HP-2β-2CD包合物和原药液四种剂型,并对上述四种剂型在经皮给药过程中,18小时后的皮肤残留量进行了研究,建立了一种准确而又稳定的应用于经皮给药系统的20(S)-PPD的测定方法,该研究对今后20(S)-PPD不同剂型不同给药途径的研究奠定了一定的基础。20(S)-PPD难溶于水,不同PH值的介质对于它的表观油水分配系数影响也不大,其大鼠在体肠吸收研究表明,吸收速度从大到小以此为:十二指肠、空肠、回肠、结肠,在整个肠段均有吸收且吸收良好。在开发剂型时应适当增加其在小肠的滞留时间,以提高生物利用度[15]。药物制剂溶的出度将直接影响它在体内的生物利用度,所以有学者[9]研究了20(S)-PPD溶出度测定方法,以2010版药典中溶出度测定的浆法为参考,用0.5%十二烷基硫酸钠水溶液为溶出介质,转速为100r·min,采用SAS软件计算了该药物的溶出度Weibull分布参数和特征溶出参数。另外还有学者对于20(S)-PPD的药动学进行了研究,为其进一步的剂型开发和评价提供参考,张丹等[16]建立了一种快速而又灵敏的测定血浆样品中20(S)-PPD的方法,其利用液相质联用技术,采用甲醇-乙腈-10mM乙酸铵(47.5:47.5:5)为流动相,正离子模式扫描;并将该方法成功的应用于健康志愿者口服20(S)-PPD胶囊后的血药浓度的测定。3生物活性研究3.1抗肿瘤作用陈明侠等[17]研究表明20(S)-PPD对于小鼠的肝癌H2、Lewis肺癌和黑色素瘤B三种模型的癌症都有抑制作用,其抗肿瘤作用可能与提高非特异性免疫因子NK细胞的活性和特异性免疫因子IL-2含量有关。张锐等[18-19]观察20(S)-PPD对于人肝癌细胞株(S)MMC-7721和小细胞肺癌A549细胞增殖的抑制作用,结果表明20(S)-PPD无论在体内还是体外均可有效的抑制肿瘤细胞的增值,诱导肿瘤细胞的凋亡。冷吉燕等[20]研究发现20(S)-PPD可通过抑制肿瘤生长因子VEGF和bFGF来发挥抗肿瘤作用。郭亚雄等[21]发现了20(S)-PPD具有明显的抑制前列腺癌RM-1细胞生长的作用,并且进一步研究表明其机制可能与下调CyclinD1蛋白表达有关。赵丽晶等[22]采用RT-PCR、WesternBlot方法检测bax基因的转录及蛋白表达,AnnexinV-EGFP/PI双染色法、TUNUL染色法检测siha细胞细胞凋亡情况,结果表明20(S)-PPD可通过上调bax基因,来诱导siha细胞的凋亡。Guo等[23]研究发现20(S)-PPD可通过诱导或上调与内质网应激有关的蛋白和基因等,使内质网的形态变化等,来诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡。3.2对神经系统的作用20(S)-PPD可有效的抑制PTZ诱导的小鼠和大鼠癫痫的发作并延长癫痫发作潜伏期,其机理可能与该化合物抑制了神经元细胞的兴奋性有关;另外20(S)-PPD还可以降低gultamate诱导的神经细胞的死亡率,保护神经元细胞,体内药理学试验还发现,20(S)-PPD对于东莨菪碱和乙醇所致的小鼠记忆障碍也有一定的改善作用[24]。许长江等[25]通过经典的抑郁模型:悬尾实验,强迫游泳实验和脑损伤模型-嗅球切除模型等对于20(S)-PPD的抗抑郁作用进行了研究,结果表明20(S)-PPD具有和氟西汀相当的抗抑郁作用,但是其机理还有待进一步的研究证实。YinDuan等[26]研究发现在哺乳动物的大脑中20(S)-PPD可通过改变神经毒素的结合位点,有效的抑制激活的Na+通道的活性。3.3其他作用姚远等[27]运用计算机虚拟的方法,采用Insi-ghtII/Affinity程序,通过分析CYP2C9-PPD复合物中的CYP2C9与PPD,CYP3A4-PPD复合物中CYP3A4与PPD的相互作用能和Ludi评分,结果表明CYP2C9与PPD之间作用较强,PPD对于的抑制作用远远强于对CYP3A4抑制作用。提示20(S)-PPD通过抑制CYP2C9的活性来增加由该酶代谢的药物的半衰期,而对于CYP3A4代谢的药物的影响较小。刘军等[28]研究发现一定剂量的20(S)-PPD对于野生型和ΔF508突变型CFTR氯离子通道均有一定的激活作用,该作用迅速可逆。20(S)-PPD的这一作用的发现为今后阐明CFTR氯离子通道的调控机制,以及用于与CFTR突变有关的疾病,如囊性纤维化病、干眼病、慢性胰腺炎等,治疗药物的开发,提供了很好的先到化合物。4.讨论人参做为为一种珍贵的中药材,无论是在治疗疾病方面还是在保健方面,一直以来都是热点。做为人参皂苷元化合物的20(S)-PPD也得到了广泛的研究,在抗肿瘤方面,20(S)-PPD可以通过增强机体免疫和直接的细胞毒作用来杀死肿瘤细胞,另外20(S)-PPD还可以抑制肿瘤间质血管生成,阻止肿瘤细胞的生长。对于神经系统方面,20(S)-PPD可以抗癫痫、抗抑郁、增强学习能力等等,也越来越受到人们的关注。各方面都提示20(S)-PPD是一个很具有开发价值的化合物。参考文献[1]张贵明,赵余庆.人参二醇的现代药学与生物活性研究进展[J].中国现代中药,2008,10(10):8-10,33.[2]李绪文,金永日,桂明玉,等.碱催化降解法制备抗癌活性化合物20(S)-原人参二醇[J].高等学校化学学报,2006,27(3):478-481.[3]梁国兴,林莉,白万里,等.原人参二醇和三醇的制备[J].北京师范大学学报,2011,47(2):167-168.[4]惠永正,刘俊耀,杨志奇,等.原人参二醇和原人参三醇的制备方法[P].中国专利:1529882A,2005-1-26.[5]张春红,关丰,张连学.提高碱水解法制备原人参二醇得率的初步研究[J].包头医学院学报,2011,27(6):1-2.[6]LeiLiu,Xue-MeiZhu,Qi-JunWang,etal.Enzymaticpreparationof20(S,R)-protopanaxadiolbytransformationof20(S,R)-Rg3fromblackgi-nseng[J].Phytochemistry,2010,71(13):1514-1520.[7]陈婧,韩美华,季宇彬,等.20(S)-原人参二醇药质体药物含量及包封率的测定[J].中国新药杂志,2010,19(10):892-895.[8]李绪文,林燕飞,郑莹,等.RP-HPLC法测定西洋参茎叶皂苷酸、碱降解物中20(S)-原人参二醇的含量[J].吉林大学学报(医学版),2006,32(2):353-356.[9]王冰,浦益琼,陶建生,等.20(S)-原人参二醇片含量测定及体外评价方法的研究[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(18):89-94.[10]金圣煊,孙静芸,林燕飞,等.原人参二醇冻干乳剂及其制备方法:中国专利,CN1850099[P].2006.10.25.[11]金圣煊,孙静芸,张龙清,等.原人参二醇固体分散体制备方法:中国专利,CN1879647[P].2006.04.29.[12]韩美华,陈婧,陈士林,等.20(S)-原人参二醇药质体的制备及体外评价[J].中国中药杂志,2010,35(7):842-846.[13]韩美华,陈婧,陈士林,等.氢化磷脂制备原人参二醇药质体及体外评价[J].中国新药杂志,2010,19(10):888-891.[14]陈婧,韩美华,王键,等.20(S)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