凝胶电泳-PPT

凝胶电泳分离纯化的原理及应用NucleicAcidGelElectrophoresis时间：2014-9-27一、背景知识介绍二、凝胶电泳具体实验操作三、应用一、背景知识介绍电泳（electrophoresis）：带电物质在电场中向相反电极移动的现象。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。电泳的基本原理：在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积，即F＝QE。质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：F＝F′即QE＝6πrην球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。电泳迁移率（m,electrophoreticmobility）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。为了获得好的电泳结果，应尽量减少电荷效应，增加分子筛效应。常用的凝胶电泳有两类：琼脂糖凝胶电泳：分辨率稍低，适于较大分子。聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨率高，适于较小分子。凝胶电泳的检测灵敏度与凝胶的类型和密度相关琼脂糖凝胶的检测灵敏度在0.2～50Kb之间;聚丙烯酰胺的检测灵敏度在1～1000bp之间琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离,如下表所示:核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA(covalentlyclosedcircular，简称cccDNA)＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为0(Rm=O)，而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rm＞O)，由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。琼脂糖凝胶电泳优点（1）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%～99%），近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸收吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。（2）琼脂糖呈透明状，无紫外吸收，电泳后的样品可直接用紫外检测；电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。（3）操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1kb的DNA片段和DNA序列分析。其装载的样品量大，回收DNA纯度高。长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离。聚丙烯胺凝胶电泳优点：（1）分辨率高；（2）载样量大；1cm1mm的加样孔加入10g分辨率不下降，而琼脂糖0.5cm1mm加样孔加入100-500ng的DNA分辨率下降。（3）回收DNA纯度高；（4）机械强度高，韧性好。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1kb的DNA片段和DNA序列分析。其装载的样品量大，回收DNA纯度高。长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离。（一）实验材料和试剂实验材料：PCR产物,植物基因组DNA,质粒DNA等；实验试剂：电泳缓冲液；电泳载样缓冲液；电泳染料。（二）实验仪器微波炉凝胶电泳槽凝胶成像系统（三）DNA的迁移速率决定因素1DNA分子的大小双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；2琼脂糖浓度浓度越低，相同核酸分子迁移越快；SeparationRangeVs.%AgaroseLowGelingAgarose4-60.02-0.43DNA的构象一般同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状。4凝胶和电泳缓冲液中的染料如：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。4.1EB染料使用EB染色注意事项（1）EB被认为是一种强致癌物质（2）EB可用来检测单链或双链核酸4.2GoldviewGoldview是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。且现在的结果表明，Goldview没有明显的毒副作用。5所用的电压低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。6电泳缓冲液常用的有TAE、TPE及TBETAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较都是常用电泳缓冲液。三者相比：1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。二凝胶电泳具体实验操作包括拿到产物之后的处理到配胶、点样、跑胶、切胶到胶回收等操作步骤。1.冷冻、离心。拿到产物之后，应先置于4℃冰箱冷冻，因为产物温度高会影响跑胶的效率以及很可能造成产物的气溶胶污染，待温度降下来后，瞬时离心。2.配胶。琼脂糖凝胶。根据产物的分子量的大小需配置不同浓度的胶。见下图：琼脂糖凝胶浓度%可分辨的线性DNA大小范围/（kb）0.35~600.61~200.70.8~100.90.5~71.20.4~61.50.2~42.00.1~3凝胶板有30ml、50ml、100ml三种，以制备50ml的0.1%的胶为例，于电子称上称取琼脂糖0.5g，倒入250ml锥形瓶，用量筒量取50ml的1×TAE缓冲液倒入锥形瓶，混匀，用锡箔纸盖住瓶口，置于电磁炉里中高火加热两分钟。同时将干净的置胶板放好、梳子插好，并备好染色剂。3.染色和倒胶。染色剂用goldview，其分辨率较EB稍差，但安全性更高。使用时避免其接触皮肤和眼睛。根据经验30ml的胶加4.5μL、50ml加7.5μL、100ml加10μL。待锥形瓶中凝胶溶液冷却至60℃左右时（不烫手），将goldview加入其中，摇匀，然后将凝胶溶液倒入置胶板上。避免气泡。待胶凝固后（约15~30min），垂直拔出梳子，将胶放入电泳槽中，点样孔靠近负极。电泳液液面应至少高出胶板表面1~2mm。4.加样。取一只PE手套，铺平。根据样本个数将loadingbuffer点于手套上，一般每10μL点8~10个，吸取6μL样本和loadingbuffer吹打3~4次混匀后按顺序加入点样孔（小孔）中，点样时要预留出点marker的孔，一般maker点在两边紧邻样本的点样孔中。loadingbuffer的功能主要有两个。第一、指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二、里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。5.电泳：点完样后，将胶摆正，盖上电泳槽盖，设好电压电流以及跑胶时间，按启动开始跑胶。一般电压用5V/cm。一般等loadingbuffer中的溴酚蓝跑到胶的2/3处，即可关闭电泳仪，将胶取出送至成像仪拍照分析。6.胶回收：跑完胶后，如有需要，可做胶回收，首先是切胶，将胶放在紫外分析仪的平台上，打开开关，在紫外下可以看到清楚的目的条带，迅速用刀片将目的条带切下，关闭电源，将目的条带装入已标记好并称重过的1.5ml离心管中，再次称重。然后可用TIANGEN的胶回收试剂盒进行DNA的回收。附1.常用电泳缓冲液配方：缓冲液工作溶液贮存液（1000ml）Tris-乙酸（TAE）1×∶0.04mol/LTris-乙酸0.001mol/LEDTA50×∶242gTrisNa2EDTA·2H2O37.2g57.1ml冰乙酸定容至1LTris-磷酸（TPE）1×∶0.09mol/LTris-磷酸0.002mol/LEDTA10×∶108gTris15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）40ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）Tris-硼酸（TBE）0.5×∶0.045mol/LTris-硼酸0.001mol/LEDTA5×∶54gTris27.5g硼酸20ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）附2.核酸电泳常见问题及解决方案：问题可能原因解决方法DNAMarker降解核酸酶污染每次吸取时更换灭菌枪头，勿将电泳缓冲液带入管中；用后密闭4°C保存保存不当4°C或-20°C保存，避免多次反复冻融；不可加热DNAMarker无法正确分离琼脂糖质量差使用质量可靠的琼脂糖制胶电泳缓冲液多次使用后失效更换缓冲液条带黯淡核酸浓度过低增加上样量核酸降解使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品DNA条带被示踪染料掩盖提高上样量；避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料问题可能原因解决方法条带模糊或弥散电泳缓冲液多次使用后失效更换缓冲液核酸部分降解使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质电压过低，电泳时间过长根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳染色时间过长或拍照前放置过久，DNA条带弥散电泳结束后及时观察、拍照条带大小不正确核酸降解或形成聚合物加热处理或重新制备样品λDNA酶切Marker的cos位点复性电泳前65度加热5分钟，冰上冷却5分钟以后再上样相同分子量的DNA片段由于结构或序列的差异而有不同的迁移率判断DNA分子是否有特殊结构，如缺口、超螺旋、二聚体等；富含AT碱基的DNA迁移率比同分子量富含GC碱基的DNA片段慢梳子变形，点样孔不在同一水平线上使用完好的梳子制胶问题可能原因解决方法条带缺失DNA条带分子量过大使用脉冲凝胶电泳分子量接近的DNA条带没有分开选择适当的凝胶浓度进行电泳电泳缓冲液使用不当SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段电泳时间过长或电压过高，DNA走出凝胶缩短电泳时间，调整电压电极插反，DNA走出凝胶正确连接电极方向问题可能原因解决方法带型异常不同样本的上样条件不同选用相同的上样缓冲液，上样量尽可能接近上样量过大或过小选择合适大小的上样孔，样品应完全覆盖点样孔底部核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质电泳缓冲液未完全浸没凝胶上样和电泳时，确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和DNA变性根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳凝